硝(xiao)酸還(hai)原(yuan)酶（NiR）是(shi)壹(yi)類(lei)能催(cui)化(hua)亞(ya)硝(xiao)酸鹽(yan)還原(yuan)的酶(mei)，廣泛(fan)存在於(yu)微生物及(ji)植物體(ti)內(nei)，是(shi)自(zi)然(ran)界(jie)氮循(xun)環(huan)過程中的關(guan)鍵(jian)酶，可(ke)以(yi)將(jiang)亞(ya)硝(xiao)酸鹽(yan)降(jiang)解為(wei) NO 或NH3，從而減少環(huan)境(jing)中亞硝(xiao)態(tai)氮的(de)積累(lei)，降(jiang)低因(yin)亞硝(xiao)酸鹽(yan)累(lei)積而造成的對(dui)生物體(ti)的(de)毒(du)害(hai)作(zuo)用。
亞硝(xiao)酸還(hai)原(yuan)酶試(shi)劑(ji)盒(he) 氮(dan)代(dai)謝(xie)

亞(ya)硝(xiao)酸還(hai)原(yuan)酶（Nitrite reductase，NiR）試(shi)劑(ji)盒(he)說(shuo)明書(shu)

分(fen)光光度法 50 管(guan)/24 樣

亞(ya)硝(xiao)酸還(hai)原(yuan)酶試(shi)劑(ji)盒(he) 氮(dan)代(dai)謝(xie)

正式測(ce)定(ding)前(qian)務必取(qu) 2-3 個預(yu)期差異(yi)較大(da)的樣本(ben)做預(yu)測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意(yi)義(yi)：

硝(xiao)酸還(hai)原(yuan)酶（NiR）是(shi)壹(yi)類(lei)能催(cui)化(hua)亞(ya)硝(xiao)酸鹽(yan)還原(yuan)的酶(mei)，廣泛(fan)存在於(yu)微生物及(ji)植物體(ti)內(nei)，是(shi)自(zi)然(ran)界(jie)氮循(xun)環(huan)過程中的關(guan)鍵(jian)酶，可(ke)以(yi)將(jiang)亞(ya)硝(xiao)酸鹽(yan)降(jiang)解為(wei) NO 或(huo)NH3，從而減少環(huan)境(jing)中亞硝(xiao)態(tai)氮的(de)積累(lei)，降(jiang)低因(yin)亞硝(xiao)酸鹽(yan)累(lei)積而造成的對(dui)生物體(ti)的(de)毒(du)害(hai)作(zuo)用。

測(ce)定(ding)原(yuan)理：

亞(ya)硝(xiao)酸還(hai)原(yuan)酶可(ke)將NO2—還(hai)原(yuan)為(wei)NO，使樣品(pin)中參與(yu)重(zhong)氮化(hua)反應生成紫紅色(se)化(hua)合物的(de) NO —減少，即540nm 處吸光值的變化(hua)可(ke)反應亞(ya)硝(xiao)酸還(hai)原(yuan)酶的(de)活性(xing)。

組(zu)成：

試(shi)劑(ji)二(er)：粉劑(ji)×1 瓶，4℃保存。臨(lin)用前加(jia) 12ml 蒸餾水(shui)溶解。

試(shi)劑(ji)三(san)：液體 12ml×1 瓶，4℃保存。（如出(chu)現(xian)沈澱(dian)可(ke)以(yi) 70-80℃加(jia)熱(re)溶解）

試(shi)劑(ji)四：液(ye)體(ti) 25ml×1 瓶，4℃避(bi)光保存。（如出(chu)現(xian)沈澱(dian)可(ke)以(yi) 70-80℃加(jia)熱(re)溶解）工作(zuo)液：臨(lin)用前根據(ju)用量將試劑(ji)四和(he)試(shi)劑(ji)五(wu)以(yi) 1:1 的(de)比例混(hun)合。

自(zi)備儀器和(he)用品：

天(tian)平、研缽、可(ke)見分(fen)光光度計(ji)、水(shui)浴(yu)鍋、低溫(wen)離心機、1ml 玻璃(li)比色(se)皿(min)。

酶(mei)液提(ti)取(qu)：

組(zu)織(zhi)：按照組(zu)織(zhi)質量（g）：提(ti)取(qu)液體(ti)積(ml)為(wei) 1：5~10 的比例（建(jian)議稱取(qu)約 0.1g 組織(zhi)，加(jia)入 1ml 提(ti)取(qu)液），進(jin)行(xing)冰浴(yu)勻漿。10000g 4℃離心 10min，取(qu)上清(qing)，置冰上待測(ce)。

細(xi)菌、真菌(jun)：按照細(xi)胞(bao)數量(liang)（104 個(ge)）：提(ti)取(qu)液體(ti)積（ml）為(wei) 500~1000：1 的比例（建(jian)議 500 萬(wan)細胞(bao)加(jia)入 1ml 提(ti)取(qu)液），冰(bing)浴(yu)超(chao)聲波破(po)碎細(xi)胞（功率(lv) 300w，超(chao)聲 3 秒，間(jian)隔 7 秒，總(zong)時間(jian) 3min）；然(ran)後(hou) 10000g， 4℃離心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)置於(yu)冰(bing)上待測(ce)。

測(ce)定(ding)操作(zuo)表：

計(ji)算(suan)公式(shi)：

標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x 為(wei)標(biao)準(zhun)品(pin)濃(nong)度（μmol/ml），y 為(wei)吸光值（A 標(biao)準(zhun)管(guan)-A 空(kong)白(bai)管(guan)）。

按照蛋白(bai)含(han)量(liang)計(ji)算(suan)

酶(mei)活單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每毫(hao)克組(zu)織(zhi)蛋白(bai)每小時(shi)還原(yuan) 1μmol NO2ˉ的量(liang)為(wei)壹個酶活(huo)力(li)單(dan)位(wei)。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空(kong)白(bai)管(guan)-(A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan))-0.0072]÷1.3594×V 標(biao)÷（V 樣×Cpr）÷T = 1.47×（A

空(kong)白(bai)管(guan)-A 測(ce)定(ding)管(guan)+A 對(dui)照管(guan)-0.0072）÷Cpr

按照樣本(ben)質量計(ji)算(suan)

酶(mei)活單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每克組(zu)織(zhi)每小時(shi)還原(yuan) 1μmol NO2ˉ的量(liang)為(wei)壹個酶活(huo)力(li)單(dan)位(wei)。

NiR（μmol/h/g 鮮(xian)重）=[A 空白(bai)管(guan)-(A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan))-0.0072]÷1.3594×V 標(biao)÷（W ×V 樣÷V 樣總(zong)）÷T = 1.47×

（A 空(kong)白(bai)管(guan)-A 測(ce)定(ding)管(guan)+A 對(dui)照管(guan)-0.0072）÷W

按照細(xi)胞(bao)數量(liang)計(ji)算(suan)

酶(mei)活單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每 104 個細(xi)胞每小時(shi)還原(yuan) 1μmol NO2ˉ的量(liang)為(wei)壹個酶活(huo)力(li)單(dan)位(wei)。

NiR（μmol/h /104 cell）= [A 空(kong)白(bai)管(guan)-(A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan))-0.0072]÷1.3594×V 標(biao)÷（細(xi)胞(bao)數量(liang)×V 樣÷V 樣總(zong)）

÷T = 1.47×（A 空(kong)白(bai)管(guan)-A 測(ce)定(ding)管(guan)+A 對(dui)照管(guan)-0.0072）÷細胞(bao)數量(liang)

V 標(biao)：標(biao)準(zhun)液(ye)體(ti)積，0.2ml；V 樣：體(ti)系(xi)中加(jia)入樣本(ben)體積，0.1ml；V 樣總(zong)：加(jia)入提(ti)取(qu)液體(ti)積，1ml；T：反應時(shi)間(jian)，1h； Cpr：樣本(ben)蛋白(bai)含(han)量(liang)；W：樣本(ben)質量，g

註(zhu)意事(shi)項：

配(pei)制(zhi)好的(de)工作(zuo)液 3 天(tian)內(nei)使用完。

若吸光值超(chao)過 3，將上清(qing)液進(jin)行(xing)適(shi)當(dang)的稀(xi)釋(shi)後(hou)再加(jia)入工作(zuo)液顯色(se)，並在計(ji)算(suan)公式(shi)中乘以(yi)稀(xi)釋(shi)倍(bei)數。

嚴(yan)格(ge)控(kong)制(zhi)顯色(se)時(shi)間(jian)，否則會對(dui)結果(guo)有影(ying)響。

標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)線(xian)性(xing)範圍(wei)為(wei) 0.03μmol/ml-1.5μmol/ml。

A 空(kong)白(bai)管(guan)-（A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan)）線性(xing)範圍(wei)為(wei) 0.02-3。

亞(ya)硝(xiao)酸還(hai)原(yuan)酶試(shi)劑(ji)盒(he) 氮(dan)代(dai)謝(xie)