β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛(fan)存(cun)在(zai)於動(dong)物(wu)、植物(wu)、微(wei)生(sheng)物(wu)和(he)培(pei)養細(xi)胞(bao)中(zhong)，能夠(gou)催化(hua)β半乳糖(tang)苷(gan)化(hua)合(he)物(wu)中β半乳糖(tang)苷(gan)鍵水解(jie)，此(ci)外(wai)還具有(you)轉半乳糖(tang)苷(gan)的(de)作用(yong)。β-GAL不(bu)僅(jin)可(ke)為植(zhi)物(wu)的快(kuai)速生(sheng)長釋放儲存(cun)的(de)能量(liang)，還能在(zai)正(zheng)常的(de)多糖代(dai)謝(xie)、細(xi)胞(bao)壁組(zu)分(fen)代(dai)謝(xie)以(yi)及(ji)衰(shuai)老時細胞(bao)壁降解(jie)過(guo)程(cheng)中催化(hua)多糖、糖蛋白以(yi)及(ji)半乳糖(tang)脂末(mo)端半(ban)乳糖(tang)殘(can)基(ji)的(de)水解(jie)，釋(shi)放自由(you)的半乳糖(tang)。
β-半(ban)乳糖(tang)苷(gan)酶試(shi)劑(ji)盒(he) 糖(tang)代(dai)謝(xie)

β-半(ban)乳糖(tang)苷(gan)酶（β-Galactosidase, β-GAL）試(shi)劑(ji)盒(he)說(shuo)明書

微(wei)量(liang)法 100 管(guan)/48 樣

β-半(ban)乳糖(tang)苷(gan)酶試(shi)劑(ji)盒(he) 糖(tang)代(dai)謝(xie)

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前(qian)務必取(qu) 2-3 個預(yu)期(qi)差(cha)異(yi)較(jiao)大的(de)樣本(ben)做預(yu)測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意義：

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣(guang)泛(fan)存(cun)在(zai)於動(dong)物(wu)、植物(wu)、微(wei)生(sheng)物(wu)和(he)培(pei)養細(xi)胞(bao)中(zhong)，能夠(gou)催化(hua)β半乳糖(tang)苷(gan)化(hua)合(he)物(wu)中β半乳糖(tang)苷(gan)鍵水解(jie)，此(ci)外(wai)還具有(you)轉半乳糖(tang)苷(gan)的(de)作用(yong)。β-GAL不(bu)僅(jin)可(ke)為植(zhi)物(wu)的快(kuai)速生(sheng)長釋放儲存(cun)的(de)能量(liang)，還能在(zai)正(zheng)常的(de)多糖代(dai)謝(xie)、細(xi)胞(bao)壁組(zu)分(fen)代(dai)謝(xie)以(yi)及(ji)衰(shuai)老時細胞(bao)壁降解(jie)過(guo)程(cheng)中催化(hua)多糖、糖蛋白以(yi)及(ji)半乳糖(tang)脂末(mo)端半(ban)乳糖(tang)殘(can)基(ji)的(de)水解(jie)，釋(shi)放自由(you)的半乳糖(tang)。

測(ce)定(ding)原理：

β-GAL 分(fen)解(jie)對(dui)-硝基(ji)苯-β-D-吡喃半(ban)乳糖(tang)苷(gan)生(sheng)成(cheng)對(dui)-硝(xiao)基(ji)苯(ben)fen，後(hou)者(zhe)在(zai) 400nm 有(you)最(zui)大吸收峰，通(tong)過(guo)測(ce)定(ding)吸光值升(sheng)高速率(lv)來計算(suan)β-GAL 活性。

組(zu)成(cheng)：

試(shi)劑(ji)壹：粉(fen)劑(ji)×1 瓶(ping)，-20℃保存(cun)；臨用(yong)前(qian)加入(ru) 2.5ml 蒸餾(liu)水，充(chong)分(fen)溶解(jie)備(bei)用(yong)；用(yong)不(bu)完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)仍(reng)-20℃保存(cun)。

自備(bei)儀器(qi)和(he)用(yong)品(pin)：

可(ke)見分(fen)光光度(du)計/酶標儀、臺(tai)式(shi)離心機(ji)、水浴鍋(guo)、可(ke)調式(shi)移(yi)液(ye)器、微(wei)量(liang)石(shi)英(ying)比(bi)色皿(min)/96 孔板、研缽、冰(bing)和(he)蒸餾(liu)水。

粗(cu)酶液(ye)提取(qu)：

1、細(xi)菌(jun)或培養細(xi)胞(bao)：先(xian)收(shou)集(ji)細菌(jun)或細胞到離心管(guan)內，離心後(hou)棄上清；按(an)照(zhao)細(xi)菌(jun)或細胞數量(liang)（104 個）：提取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)（ml）為 500~1000：1 的(de)比(bi)例(li)（建議(yi) 500 萬(wan)細菌(jun)或細胞加入(ru) 1ml 提取(qu)液(ye)），超(chao)聲(sheng)波(bo)破(po)碎細(xi)菌(jun)或細胞（冰(bing)浴，功(gong)率(lv) 20％或 200W，超(chao)聲(sheng) 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重(zhong)復(fu) 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取(qu)上清，置冰(bing)上待(dai)測(ce)。

2、組(zu)織(zhi)：按(an)照(zhao)組(zu)織(zhi)質(zhi)量（g）：提取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)(ml)為 1：5~10 的(de)比(bi)例(li)（建議(yi)稱(cheng)取(qu)約 0.1g 組(zu)織(zhi)，加入(ru) 1ml 提取(qu)液(ye)），進(jin)行冰(bing)浴勻(yun)漿(jiang)。15000g 4℃離心 10min，取(qu)上清，置冰(bing)上待(dai)測(ce)。

3、培(pei)養液(ye)等液(ye)體(ti)樣本(ben)：直(zhi)接(jie)檢(jian)測(ce)

測(ce)定(ding)步驟(zhou)：

1、分(fen)光光度(du)計或酶標儀預(yu)熱 30min 以(yi)上(shang)，調節(jie)波(bo)長至(zhi) 400nm，蒸餾(liu)水調零。

2、樣本(ben)測(ce)定(ding)（在(zai) EP 管或 96 孔板中依次加入(ru)下列試(shi)劑(ji)）：

迅(xun)速混勻(yun)，放入(ru) 37℃保溫(wen) 30min

充(chong)分(fen)混勻(yun)， 400nm 處測(ce)定(ding)吸光值A，計算(suan)ΔA=A 測(ce)定(ding)-A 對(dui)照。每(mei)個測(ce)定(ding)管需設壹個對(dui)照管(guan)。

β-GAL 活性計算(suan)：

用(yong)微(wei)量(liang)石(shi)英(ying)比(bi)色皿(min)測(ce)定(ding)的計算(suan)公(gong)式(shi)如下

標準條件(jian)下測(ce)定(ding)的回歸方(fang)程為y = 0.00585x -0.0027；x 為標準品(pin)濃度(du)（nmol/ml），y 為吸光值。

按(an)樣本(ben)蛋白濃度(du)計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織(zhi)蛋白每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1nmol 對(dui)-硝基(ji)苯fen定(ding)義為壹個酶活性單(dan)位。

β-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反(fan)總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按(an)樣本(ben)鮮重(zhong)計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei)g 組(zu)織(zhi)每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1nmol 對(dui)-硝基(ji)苯fen定(ding)義為壹個酶活性單(dan)位。

β-GAL 活性(nmol/min/g 鮮重(zhong))=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反(fan)總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

按(an)細(xi)菌(jun)或細胞密(mi)度(du)計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬(wan)個細(xi)菌(jun)或細胞每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1nmol 對(dui)-硝基(ji)苯fen定(ding)義為壹個酶活性單(dan)位。

β-GAL 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反(fan)總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

按(an)液(ye)體(ti)體(ti)積(ji)計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei)ml 樣本(ben)每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1nmol 對(dui)-硝基(ji)苯fen定(ding)義為壹個酶活性單(dan)位。

β-GAL 活性(nmol/min/ml)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反(fan)總]÷V 樣÷T

=39.89×(ΔA+0.0027)

V 反(fan)總：反(fan)應(ying)體(ti)系總體(ti)積(ji)，0.07ml；V 樣：加入(ru)反(fan)應(ying)體(ti)系中樣本(ben)體(ti)積(ji)，0.01ml；V 樣總：加入(ru)提取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)， 1ml；Cpr：樣本(ben)蛋白質(zhi)濃度(du)，mg/ml；W：樣本(ben)質(zhi)量，g； 500：細(xi)胞或細菌(jun)總數(shu)，500 萬(wan)；T：反(fan)應(ying)時(shi)間， 30min。

用(yong) 96 孔(kong)板測(ce)定(ding)的計算(suan)公(gong)式(shi)如下

標準條件(jian)下測(ce)定(ding)的回歸方(fang)程為y = 0.0039x -0.0027；x 為標準品(pin)濃度(du)（nmol/ml），y 為吸光值。

按(an)樣本(ben)蛋白濃度(du)計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織(zhi)蛋白每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1nmol 對(dui)-硝基(ji)苯fen定(ding)義為壹個酶活性單(dan)位。

β-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反(fan)總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按(an)樣本(ben)鮮重(zhong)計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei)g 組(zu)織(zhi)每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1nmol 對(dui)-硝基(ji)苯fen定(ding)義為壹個酶活性單(dan)位。

β-GAL 活性(nmol/min/g 鮮重(zhong))=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反(fan)總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

按(an)細(xi)菌(jun)或細胞密(mi)度(du)計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬(wan)個細(xi)菌(jun)或細胞每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1nmol 對(dui)-硝基(ji)苯fen定(ding)義為壹個酶活性單(dan)位。

β-GAL 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反(fan)總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.12×(ΔA +0.0027)

按(an)液(ye)體(ti)體(ti)積(ji)計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei)ml 樣本(ben)每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1nmol 對(dui)-硝基(ji)苯fen定(ding)義為壹個酶活性單(dan)位。

β-GAL 活性(nmol/min/ml)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反(fan)總]÷V 樣

÷T=59.83×(ΔA+0.0027)

V 反(fan)總：反(fan)應(ying)體(ti)系總體(ti)積(ji)，0.07mL；V 樣：加入(ru)反(fan)應(ying)體(ti)系中樣本(ben)體(ti)積(ji)，0.01mL；V 樣總：加入(ru)提取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)， 1mL；Cpr：樣本(ben)蛋白質(zhi)濃度(du)，mg/mL；W：樣本(ben)質(zhi)量，g； 500：細(xi)胞或細菌(jun)總數(shu)，500 萬(wan)；T：反(fan)應(ying)時(shi)間， 30min。

β-半(ban)乳糖(tang)苷(gan)酶試(shi)劑(ji)盒(he) 糖(tang)代(dai)謝(xie)