α-GAL (EC 3.2.1.22)廣(guang)泛存(cun)在(zai)於動(dong)物、植物、微(wei)生(sheng)物和(he)培(pei)養細(xi)胞(bao)中(zhong)，能(neng)專壹地(di)催化(hua)α半乳(ru)糖(tang)苷(gan)鍵(jian)的(de)水(shui)解，主(zhu)要參(can)與棉子糖(tang)、水(shui)蘇(su)糖(tang)、蜜二糖(tang)和(he)半乳(ru)甘露聚(ju)糖(tang)等(deng)半(ban)乳(ru)糖(tang)苷(gan)的(de)降(jiang)解。α-GAL 對於植物種(zhong)子(zi)的(de)萌(meng)發至關重(zhong)要，種(zhong)子(zi)萌(meng)發初(chu)期(qi)，其催化(hua)產(chan)生(sheng)的(de) D-半(ban)乳糖(tang)通過糖(tang)酵(jiao)解途(tu)徑迅(xun)速轉化(hua)和(he)消耗，為(wei)種(zhong)子(zi)的(de)萌(meng)發提供最初(chu)的(de)能(neng)量(liang)來源(yuan)，後(hou)期(qi)則(ze)主(zhu)要參(can)與細(xi)胞(bao)壁儲(chu)藏多(duo)糖(tang)水(shui)解。
α-半(ban)乳糖(tang)苷(gan)酶(mei)試劑盒(he) 糖(tang)代(dai)謝(xie)

α-半乳糖(tang)苷(gan)酶(mei)（α-Galactosidase, α-GAL）試劑盒(he)說明(ming)書(shu)

微(wei)量(liang)法(fa) 100 管/48 樣

α-半乳糖(tang)苷(gan)酶(mei)試劑盒(he) 糖(tang)代(dai)謝(xie)

正式測(ce)定前務(wu)必(bi)取 2-3 個(ge)預(yu)期(qi)差異(yi)較大的(de)樣(yang)本做預(yu)測(ce)定測(ce)定意(yi)義(yi)：

α-GAL (EC 3.2.1.22)廣(guang)泛存(cun)在(zai)於動(dong)物、植物、微(wei)生(sheng)物和(he)培(pei)養細(xi)胞(bao)中(zhong)，能(neng)專壹地(di)催化(hua)α半乳糖(tang)苷(gan)鍵(jian)的(de)水(shui)解，主要參(can)與棉子糖(tang)、水(shui)蘇(su)糖(tang)、蜜二糖(tang)和(he)半乳(ru)甘露聚(ju)糖(tang)等(deng)半(ban)乳(ru)糖(tang)苷(gan)的(de)降(jiang)解。α-GAL 對於植物種(zhong)子(zi)的(de)萌(meng)發至關重(zhong)要，種(zhong)子(zi)萌(meng)發初(chu)期(qi)，其催化(hua)產(chan)生(sheng)的(de) D-半(ban)乳糖(tang)通過糖(tang)酵(jiao)解途(tu)徑迅(xun)速轉化(hua)和(he)消耗，為(wei)種(zhong)子(zi)的(de)萌(meng)發提供最初(chu)的(de)能(neng)量(liang)來源(yuan)，後(hou)期(qi)則(ze)主(zhu)要參(can)與細(xi)胞(bao)壁儲(chu)藏多(duo)糖(tang)水(shui)解。

測(ce)定原理(li)：

α-GAL 分解對-硝基苯-α-D-吡(bi)喃半乳糖(tang)苷(gan)生(sheng)成(cheng)對-硝基苯fen，後(hou)者在(zai) 400nm 有最大吸(xi)收(shou)峰，通過測(ce)定吸(xi)光(guang)值(zhi)升高速率來計(ji)算(suan)α-GAL 活性。

組(zu)成：

自(zi)備儀器和(he)用品：

可見分光光度(du)計/酶(mei)標(biao)儀、臺式離心機、水(shui)浴鍋(guo)、可(ke)調(tiao)式(shi)移液器、微(wei)量(liang)石(shi)英(ying)比(bi)色皿(min)/96 孔板、研缽、冰(bing)和(he)蒸餾水(shui)。

試劑壹：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，-20℃保存(cun)；臨用前加(jia)入 2.5ml 蒸餾水(shui)，充(chong)分(fen)溶(rong)解備用；用不完(wan)的(de)試(shi)劑仍(reng)-20℃保存(cun)。

粗(cu)酶(mei)液提取：

1、細菌(jun)或培(pei)養細(xi)胞(bao)：先收(shou)集(ji)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)到離心管內，離心後棄(qi)上清(qing)；按(an)照細菌(jun)或細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)（104 個(ge)）：提取液體(ti)積（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比(bi)例(li)（建(jian)議(yi) 500 萬(wan)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)加(jia)入 1ml 提取液），超聲(sheng)波(bo)破(po)碎(sui)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)（冰(bing)浴，功率 20％或 200W，超(chao)聲 3s，間隔 10s，重復(fu) 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上(shang)清(qing)，置冰(bing)上待測(ce)。

2、組(zu)織(zhi)：按(an)照組(zu)織(zhi)質(zhi)量(liang)（g）：提取液體(ti)積(ml)為(wei) 1：5~10 的(de)比(bi)例(li)（建(jian)議(yi)稱取約(yue) 0.1g 組(zu)織(zhi)，加(jia)入 1ml 提取液），進行(xing)冰(bing)浴勻漿(jiang)。15000g 4℃離心 10min，取上(shang)清(qing)，置冰(bing)上待測(ce)。

測(ce)定步驟：

1、分光光度計或酶(mei)標(biao)儀預(yu)熱 30min 以上，調(tiao)節(jie)波(bo)長(chang)至 400nm，蒸餾水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、樣本測(ce)定（在(zai) EP 管或 96 孔板中(zhong)依次(ci)加(jia)入下列試(shi)劑(ji)）：

迅速混勻，放入 37℃保溫(wen) 30min

充(chong)分(fen)混勻， 400nm 處測(ce)定吸(xi)光(guang)值(zhi)A，計算(suan)ΔA=A 測(ce)定-A 對照。每(mei)個(ge)測(ce)定管需設(she)壹個(ge)對照管。

α-GAL 活性計算(suan)：

用微(wei)量(liang)石(shi)英(ying)比(bi)色皿(min)測(ce)定的(de)計(ji)算(suan)公式如(ru)下

標(biao)準條(tiao)件(jian)下測(ce)定的(de)回(hui)歸方程為y = 0.00585x -0.0027；x 為標(biao)準品濃度(du)（nmol/ml），y 為吸(xi)光(guang)值(zhi)。

按樣本蛋白濃(nong)度計算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織(zhi)蛋白每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生(sheng) 1nmol 對-硝基苯fen定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性單(dan)位(wei)。

α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總(zong)]÷(V 樣(yang)×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按樣本鮮(xian)重(zhong)計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei)g 組(zu)織(zhi)每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生(sheng) 1nmol 對-硝基苯fen定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性單(dan)位(wei)。

α-GAL 活性(nmol/min/g 鮮(xian)重(zhong))=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反(fan)總(zong)]÷(W×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

按細菌(jun)或細(xi)胞(bao)密(mi)度計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬個細菌(jun)或細(xi)胞(bao)每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生(sheng) 1nmol 對-硝基苯fen定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性單(dan)位(wei)。

α-GAL 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總(zong)]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

V 反總(zong)：反(fan)應體(ti)系(xi)總(zong)體(ti)積，0.07ml；V 樣(yang)：加(jia)入反應體(ti)系(xi)中(zhong)樣本體(ti)積，0.01ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提取液體(ti)積， 1ml；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白質(zhi)濃度(du)，mg/ml；W：樣本質(zhi)量(liang)，g； 500：細胞(bao)或細(xi)菌(jun)總(zong)數(shu)，500 萬(wan)；T：反應時間， 30min。

用 96 孔板測(ce)定的(de)計(ji)算(suan)公式如(ru)下

標(biao)準條(tiao)件(jian)下測(ce)定的(de)回(hui)歸方程為y = 0.0039x -0.0027；x 為標(biao)準品濃度(du)（nmol/ml），y 為吸(xi)光(guang)值(zhi)。

按樣本蛋白濃(nong)度計算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織(zhi)蛋白每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生(sheng) 1nmol 對-硝基苯fen定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性單(dan)位(wei)。

α-GAL 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總(zong)]÷(V 樣(yang)×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按樣本鮮(xian)重(zhong)計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei)g 組(zu)織(zhi)每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生(sheng) 1nmol 對-硝基苯fen定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性單(dan)位(wei)。

α-GAL 活性(nmol/min/g 鮮(xian)重(zhong))=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反(fan)總(zong)]÷(W×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

按細菌(jun)或細(xi)胞(bao)密(mi)度計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬個細菌(jun)或細(xi)胞(bao)每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生(sheng) 1nmol 對-硝基苯fen定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性單(dan)位(wei)。

α-GAL 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總(zong)]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T

=0.12×(ΔA +0.0027)

V 反總(zong)：反(fan)應體(ti)系(xi)總(zong)體(ti)積，0.07ml；V 樣(yang)：加(jia)入反應體(ti)系(xi)中(zhong)樣本體(ti)積，0.01ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提取液體(ti)積， 1ml；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白質(zhi)濃度(du)，mg/ml；W：樣本質(zhi)量(liang)，g； 500：細胞(bao)或細(xi)菌(jun)總(zong)數(shu)，500 萬(wan)；T：反應時間， 30min。

α-半乳糖(tang)苷(gan)酶(mei)試劑盒(he) 糖(tang)代(dai)謝(xie)