PK 催化(hua)磷酸(suan)烯(xi)醇式(shi)丙tong酸(suan)和ADP 生(sheng)成ATP 和丙tong酸(suan)，乳(ru)酸(suan)脫(tuo)氫(qing)酶(mei)進壹步(bu)催化(hua)NADH 和丙tong酸(suan)生(sheng)成乳酸(suan)和NAD+，在 340nm 下(xia)測定NADH 下(xia)降(jiang)速率，即(ji)可(ke)反映(ying) PK 活(huo)性。
丙tong酸(suan)激(ji)酶(mei)試劑盒 糖酵解(jie)

丙tong酸(suan)激(ji)酶(mei)（Pyruvate kinase，PK）試劑盒說明(ming)書(shu)

微(wei)量(liang)法(fa) 100 管/96 樣

丙tong酸(suan)激(ji)酶(mei)試劑盒 糖酵解(jie)

正式(shi)測定前(qian)務必取(qu) 2-3 個(ge)預期差異較大的(de)樣本(ben)做(zuo)預測定測定意(yi)義：

PK（EC 2.7.1.40）廣泛(fan)存(cun)在於動物(wu)、植物(wu)、微(wei)生(sheng)物(wu)和培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)中(zhong)，催化(hua)糖(tang)酵解(jie)過程中(zhong)的最(zui)後壹(yi)步(bu)反應(ying)，是(shi)糖酵解(jie)過程中(zhong)的主(zhu)要(yao)限速酶(mei)之壹，也(ye)是產生(sheng)ATP 的關(guan)鍵(jian)酶(mei)之壹，因此測定PK 活(huo)性具(ju)有(you)重(zhong)要(yao)意義。

測定原(yuan)理：

PK 催化磷酸(suan)烯(xi)醇式(shi)丙tong酸(suan)和ADP 生(sheng)成ATP 和丙tong酸(suan)，乳(ru)酸(suan)脫(tuo)氫(qing)酶(mei)進壹步(bu)催化(hua)NADH 和丙tong酸(suan)生(sheng)成乳酸(suan)和NAD⁺，在 340nm 下(xia)測定NADH 下(xia)降(jiang)速率，即(ji)可(ke)反映(ying) PK 活(huo)性。

組成：

自備(bei)儀(yi)器(qi)和用品：

紫(zi)外分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)/酶(mei)標儀(yi)、臺(tai)式離(li)心機(ji)、水(shui)浴鍋、可(ke)調(tiao)式(shi)移液(ye)器(qi)、微(wei)量(liang)石英比色皿/96 孔板、研缽(bo)、冰(bing)和蒸餾水(shui)

樣本(ben)的(de)前(qian)處理：

1、細(xi)菌或培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)：先(xian)收集(ji)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)到(dao)離心(xin)管(guan)內(nei)，離心後棄上(shang)清(qing)；按照(zhao)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)數(shu)量（104 個(ge)）：提取(qu)液(ye)體積(ji)（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wan)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)加入(ru) 1ml 提取(qu)液(ye)），超聲波破(po)碎(sui)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)（冰浴(yu)，功率 20％或 200W，超(chao)聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清，置冰上(shang)待(dai)測。

2、組織：按照(zhao)組(zu)織質量（g）：提取(qu)液(ye)體積(ji)(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(cheng)取(qu)約(yue) 0.1g 組織，加入(ru) 1ml 提取(qu)液(ye)），進行冰浴勻漿(jiang)。8000g 4℃離心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清，置冰上(shang)待(dai)測。

3、血清（漿(jiang)）樣品：直(zhi)接檢測。

測定步(bu)驟(zhou)：

1、分光(guang)光(guang)度計(ji)或酶(mei)標儀(yi)預(yu)熱 30min 以(yi)上(shang)，調(tiao)節(jie)波長(chang)至 340nm，蒸餾水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、樣本(ben)測定

試劑二的配制(zhi)：臨用(yong)前(qian)取(qu)試(shi)劑二壹瓶(ping)，加入(ru) 9ml 試劑壹和 1.06ml 蒸餾水(shui)充分(fen)溶(rong)解(jie)，置(zhi)於 37℃（哺(bu)乳(ru)動物(wu)）或 25℃（其(qi)它物(wu)種）水(shui)浴 5min；現(xian)配現(xian)用。

試劑三的配制(zhi)：臨用(yong)前(qian)取(qu)試(shi)劑三壹支，加入(ru) 0.6ml 蒸餾水(shui)充分(fen)溶(rong)解(jie)待(dai)用；現(xian)配現(xian)用。

在微(wei)量(liang)石英比色皿或 96 孔板中(zhong)加入(ru) 10μl 樣本(ben)、10μl 試(shi)劑三和 180μl 試劑二，混(hun)勻，立(li)即(ji)記(ji)錄(lu) 340nm處(chu) 20s 時(shi)的吸光(guang)值(zhi)A1 和 2min20s 後的吸光(guang)值(zhi)A2，計(ji)算(suan)ΔA=A1-A2。

PK 活(huo)性計(ji)算(suan)：

用微(wei)量(liang)石英比色皿測定的(de)計(ji)算(suan)公式(shi)如(ru)下(xia)：

1、血清（漿(jiang)）中(zhong) PK 活(huo)力(li)的計(ji)算(suan):

單(dan)位的(de)定義：每毫升(sheng)血清（漿(jiang)）每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的NADH 定義為壹個酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

PK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=1608×ΔA 2、組織、細(xi)菌或細(xi)胞(bao)中(zhong) PK 活(huo)力(li)的計(ji)算(suan):

按樣本(ben)蛋(dan)白濃(nong)度計(ji)算(suan)：

單(dan)位的(de)定義：每mg 組織蛋(dan)白每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的NADH 定義為壹個酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣本(ben)鮮(xian)重計(ji)算(suan)：

單(dan)位的(de)定義：每g 組織每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的NADH 定義為壹個酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總(zong))÷T=1608×ΔA÷W

按細(xi)菌或細(xi)胞(bao)密度計(ji)算(suan)：

單(dan)位的(de)定義：每 1 萬個(ge)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的NADH 定義為壹個酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總(zong))÷T=3.216×ΔA

V 反總(zong)：反應(ying)體(ti)系(xi)總(zong)體(ti)積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消(xiao)光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色(se)皿光(guang)徑，1cm； V 樣：加入(ru)樣本(ben)體(ti)積(ji)，0.01 ml；V 樣總(zong)：加入(ru)提取(qu)液(ye)體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時(shi)間，2min；Cpr：樣本(ben)蛋(dan)白質(zhi)濃度，mg/ml；W：樣本(ben)質(zhi)量，g；500：細(xi)菌或細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)，500 萬。

用 96 孔板測定的(de)計(ji)算(suan)公式(shi)如(ru)下(xia)：

1、血清（漿(jiang)）中(zhong) PK 活(huo)力(li)的計(ji)算(suan):

單(dan)位的(de)定義：每毫升(sheng)血清（漿(jiang)）每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的NADH 定義為壹個酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

PK（nmol/min /ml）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=3216×ΔA 2、組織、細(xi)菌或細(xi)胞(bao)中(zhong) PK 活(huo)力(li)的計(ji)算(suan):

按樣本(ben)蛋(dan)白濃(nong)度計(ji)算(suan)：

單(dan)位的(de)定義：每mg 組織蛋(dan)白每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的NADH 定義為壹個酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣本(ben)鮮(xian)重計(ji)算(suan)：

單(dan)位的(de)定義：每g 組織每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的NADH 定義為壹個酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

PK（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總(zong))÷T=3216×ΔA÷W

按細(xi)菌或細(xi)胞(bao)密度計(ji)算(suan)：

單(dan)位的(de)定義：每 1 萬個(ge)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的NADH 定義為壹個酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

PK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總(zong))÷T=6.432×ΔA

V 反總(zong)：反應(ying)體(ti)系(xi)總(zong)體(ti)積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消(xiao)光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光(guang)徑，0.5cm； V 樣：加入(ru)樣本(ben)體(ti)積(ji)，0.01 ml；V 樣總(zong)：加入(ru)提取(qu)液(ye)體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時(shi)間，2min；Cpr：樣本(ben)蛋(dan)白質(zhi)濃度，mg/ml；W：樣本(ben)質(zhi)量，g；500：細(xi)菌或細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)，500 萬。

丙tong酸(suan)激(ji)酶(mei)試劑盒 糖酵解(jie)