HK（EC 2.7.1.1）廣(guang)泛存在於動(dong)物、植物、微生(sheng)物(wu)和(he)培養細胞中，是葡(pu)萄糖(tang)分(fen)解(jie)過(guo)程中的第(di)壹個(ge)關鍵(jian)酶，催化(hua)葡(pu)萄糖(tang)轉(zhuan)化為 6-磷(lin)酸葡萄糖(tang)，6-磷(lin)酸葡萄糖(tang)是(shi)糖(tang)酵(jiao)解(jie)和(he)磷(lin)酸戊(wu)糖(tang)途(tu)徑(jing)的(de)交叉(cha)點(dian)。
己(ji)糖(tang)激酶(mei)試劑盒 糖(tang)酵(jiao)解(jie)

己(ji)糖(tang)激酶(mei)(hexokinase，HK)試劑盒說明(ming)書

微量法 100 管(guan)/96樣

己(ji)糖(tang)激酶(mei)試劑盒 糖(tang)酵(jiao)解(jie)

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前(qian)務必取 2-3 個(ge)預(yu)期差異(yi)較(jiao)大的(de)樣本(ben)做(zuo)預(yu)測定測(ce)定(ding)意(yi)義(yi)：

HK（EC 2.7.1.1）廣(guang)泛存在於動(dong)物、植物、微生(sheng)物(wu)和(he)培養細胞中，是(shi)葡(pu)萄糖(tang)分(fen)解(jie)過(guo)程中的第(di)壹個(ge)關鍵(jian)酶，催化(hua)葡(pu)萄糖(tang)轉(zhuan)化為 6-磷(lin)酸葡萄糖(tang)，6-磷(lin)酸葡萄糖(tang)是(shi)糖(tang)酵(jiao)解(jie)和(he)磷(lin)酸戊(wu)糖(tang)途(tu)徑(jing)的(de)交叉(cha)點(dian)。

測(ce)定(ding)原理：

HK 催(cui)化(hua)葡萄糖(tang)合(he)成(cheng) 6-磷(lin)酸葡萄糖(tang)，6-磷(lin)酸葡萄糖(tang)脫(tuo)氫酶進(jin)壹(yi)步(bu)催(cui)化(hua) 6-磷(lin)酸葡萄糖(tang)脫(tuo)氫生(sheng)成(cheng) NADPH， NADPH 在 340nm 有(you)特征(zheng)吸收(shou)峰。

組(zu)成(cheng)：

自(zi)備(bei)儀(yi)器和(he)用品：

紫(zi)外(wai)分光光度計/酶(mei)標(biao)儀(yi)、恒(heng)溫(wen)水(shui)浴鍋(guo)、臺式(shi)離心機、可(ke)調(tiao)式(shi)移(yi)液器、微量石英比(bi)色皿/96 孔板、研(yan)缽、冰(bing)和(he)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

樣本(ben)的(de)前處(chu)理：

1、細菌或(huo)培養細胞：先(xian)收(shou)集細菌或(huo)細胞到(dao)離(li)心(xin)管(guan)內(nei)，離心後棄(qi)上(shang)清；按照(zhao)細菌或(huo)細胞數量（104 個(ge)）：提取液體(ti)積（ml）為 500~1000：1 的比(bi)例(li)（建(jian)議 500 萬(wan)細菌或(huo)細胞加入 1ml 提取液），超聲波(bo)破(po)碎細菌或(huo)細胞（冰(bing)浴，功(gong)率(lv) 20％或(huo) 200W，超聲(sheng) 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重復 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清，置(zhi)冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

2、組(zu)織：按照(zhao)組(zu)織質量（g）：提取液體(ti)積(ml)為 1：5~10 的比(bi)例(li)（建(jian)議稱取(qu)約 0.1g 組(zu)織，加(jia)入 1ml 提取液），進(jin)行(xing)冰(bing)浴勻漿。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清，置(zhi)冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

3、血清（漿(jiang)）樣品：直接檢(jian)測(ce)。

測(ce)定(ding)步驟：

1、分(fen)光光度計或(huo)酶標(biao)儀(yi)預熱(re) 30min 以(yi)上(shang)，調(tiao)節波(bo)長至(zhi) 340nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調零。

2、樣本(ben)測(ce)定

在(zai)試(shi)劑二中加入 18ml 試(shi)劑(ji)壹充分溶(rong)解(jie)，置於 37℃（哺乳(ru)動(dong)物）或(huo) 25℃（其它(ta)物(wu)種）水(shui)浴 5min；用不完的試劑(ji)分(fen)裝後-20℃保(bao)存，禁止反(fan)復凍(dong)融。

在(zai)試(shi)劑三中加入 1ml 試(shi)劑(ji)壹，充分溶(rong)解(jie)待用(yong)；用不完的試劑(ji)分(fen)裝後-20℃保(bao)存，禁止反(fan)復凍(dong)融。

在(zai)微量石英比(bi)色皿或(huo) 96 孔板中加入 10μl 樣本(ben)、10μl 試(shi)劑三和(he) 180μl 試劑(ji)二，混勻，立(li)即(ji)記(ji)錄 340nm處(chu) 20s 時(shi)的吸光值(zhi)A1 和(he) 5min20s 後的(de)吸光值(zhi)A2，計算(suan)ΔA=A2-A1。

註(zhu)意(yi)：不同(tong)勻漿組(zu)織中 HK 活力不壹(yi)樣，做(zuo)正(zheng)式(shi)試(shi)驗(yan)之(zhi)前(qian)請(qing)做(zuo) 1-2 只(zhi)預試，若(ruo)ΔA>0.5，則(ze)說明(ming)組(zu)織活力太(tai)高(gao)，必須用提取液稀釋(shi)成(cheng)適當(dang)濃(nong)度勻漿上(shang)清液（計算(suan)公式(shi)中乘(cheng)以(yi)相(xiang)應稀釋(shi)倍(bei)數），或(huo)縮短反(fan)應時(shi)間至(zhi) 2min,使(shi)ΔA<0.5，以(yi)提高(gao)檢(jian)測(ce)靈敏度。

HK 活性計算(suan)：

用(yong)微量石英比(bi)色皿測(ce)定(ding)的(de)計(ji)算(suan)公式(shi)如(ru)下：

1、血清（漿(jiang)）HK 活性

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)毫(hao)升血清（漿(jiang)）在(zai)每(mei)分鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADPH 定(ding)義(yi)為壹個酶活力單(dan)位(wei)。

HK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=643×ΔA 2、組(zu)織、細菌或(huo)細胞中 HK 活性

按樣本(ben)蛋(dan)白(bai)濃(nong)度計算(suan)

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織蛋(dan)白(bai)每(mei)分鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADPH 定(ding)義(yi)為壹個酶活力單(dan)位(wei)。

HK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按樣本(ben)鮮重計算(suan)

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)g 組(zu)織每(mei)分鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADPH 定(ding)義(yi)為壹個酶活力單(dan)位(wei)。

HK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總(zong)) ÷T=643×ΔA÷W

按細菌或(huo)細胞密(mi)度計算(suan)

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei) 1 萬(wan)個細菌或(huo)細胞每(mei)分鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADPH 定(ding)義(yi)為壹個酶活力單(dan)位(wei)。

HK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總(zong)) ÷T=1.286×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反應體(ti)系(xi)總(zong)體(ti)積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系(xi)數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色皿光徑(jing)， 1cm；V 樣：加(jia)入樣本(ben)體(ti)積，0.01 ml；V 樣總(zong)：加(jia)入提取液體(ti)積，1 ml；T：反(fan)應時(shi)間，5 min；Cpr：樣本(ben)蛋(dan)白(bai)質濃(nong)度，mg/ml；W：樣本(ben)質量，g；500：細菌或(huo)細胞總數(shu)，500 萬(wan)。

用(yong) 96 孔板測定的(de)計(ji)算(suan)公式(shi)如(ru)下：

1、血清（漿(jiang)）HK 活性

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)毫(hao)升血清（漿(jiang)）在(zai)每(mei)分鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADPH 定(ding)義(yi)為壹個酶活力單(dan)位(wei)。

HK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=1286×ΔA 2、組(zu)織、細菌或(huo)細胞中 HK 活性

按樣本(ben)蛋(dan)白(bai)濃(nong)度計算(suan)

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織蛋(dan)白(bai)每(mei)分鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADPH 定(ding)義(yi)為壹個酶活力單(dan)位(wei)。

HK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按樣本(ben)鮮重計算(suan)

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)g 組(zu)織每(mei)分鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADPH 定(ding)義(yi)為壹個酶活力單(dan)位(wei)。

HK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總(zong)) ÷T=1286×ΔA÷W

按細菌或(huo)細胞密(mi)度計算(suan)

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei) 1 萬(wan)個細菌或(huo)細胞每(mei)分鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADPH 定(ding)義(yi)為壹個酶活力單(dan)位(wei)。

HK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總(zong))÷T=2.572×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反應體(ti)系(xi)總(zong)體(ti)積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系(xi)數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑(jing)， 0.5cm；V 樣：加(jia)入樣本(ben)體(ti)積，0.01 ml；V 樣總(zong)：加(jia)入提取液體(ti)積，1 ml；T：反(fan)應時(shi)間，5 min；Cpr：樣本(ben)蛋(dan)白(bai)質濃(nong)度，mg/ml；W：樣本(ben)質量，g；500：細菌或(huo)細胞總數(shu)，500 萬(wan)。

己(ji)糖(tang)激酶(mei)試劑盒 糖(tang)酵(jiao)解(jie)