PFK（EC 2.7.1.11）廣(guang)泛(fan)存(cun)在(zai)於動物(wu)、植物(wu)、微(wei)生物(wu)和(he)培養細(xi)胞(bao)中，負責將(jiang)果糖-6-磷酸(suan)和(he)ATP 轉(zhuan)化為果糖-1,6 二磷(lin)酸(suan)和(he)ADP，是糖酵解(jie)過(guo)程(cheng)的(de)關鍵調(tiao)節(jie)酶(mei)之壹。
果糖-6-磷酸(suan)激(ji)酶(mei)試劑(ji)盒 糖酵解(jie)

果糖-6-磷酸(suan)激(ji)酶(mei)（6-phosphofructokinase，PFK）試劑(ji)盒說(shuo)明書

微量(liang)法(fa) 100 管/96 樣(yang)

果糖-6-磷酸(suan)激(ji)酶(mei)試劑(ji)盒 糖酵解(jie)

正(zheng)式測定(ding)前(qian)務必取 2-3 個(ge)預期(qi)差(cha)異較大(da)的(de)樣(yang)本(ben)做預測(ce)定測(ce)定(ding)意(yi)義(yi)：

PFK（EC 2.7.1.11）廣泛(fan)存(cun)在(zai)於動物(wu)、植物(wu)、微(wei)生物(wu)和(he)培養細(xi)胞(bao)中，負責將(jiang)果糖-6-磷酸(suan)和(he)ATP 轉(zhuan)化為果糖-1,6 二磷(lin)酸(suan)和(he)ADP，是糖酵解(jie)過(guo)程(cheng)的(de)關鍵調(tiao)節(jie)酶(mei)之壹。

測定(ding)原理(li)：

PFK 催化果糖-6-磷酸(suan)和(he)ATP 生成(cheng)果糖-1,6-二磷(lin)酸(suan)和(he)ADP，丙tong酸(suan)激(ji)酶(mei)和乳酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei)進(jin)壹步(bu)依次催化 NADH 氧(yang)化生成(cheng)NAD⁺，在(zai) 340nm 下測(ce)定NADH 下降(jiang)速率，即(ji)可(ke)反映(ying)PFK 活(huo)性(xing)。

組成(cheng)：

自備儀(yi)器(qi)和用(yong)品：

紫(zi)外(wai)分(fen)光光度計/酶(mei)標儀(yi)、水(shui)浴(yu)鍋、臺(tai)式(shi)離心(xin)機(ji)、可(ke)調(tiao)式(shi)移(yi)液(ye)器(qi)、微量(liang)石(shi)英(ying)比色皿/96 孔(kong)板、研缽(bo)、冰和蒸(zheng)餾水(shui)。

樣(yang)本(ben)的(de)前處理(li)：

1、細(xi)菌或(huo)培養細(xi)胞(bao)：先收集(ji)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)到離(li)心(xin)管(guan)內(nei)，離(li)心(xin)後(hou)棄(qi)上清(qing)；按(an)照細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)數量(liang)（104 個(ge)）：提取(qu)液體積(ji)（ml）為 1000~5000：1 的(de)比例（建(jian)議 2000 萬(wan)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)加(jia)入 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)），超聲(sheng)波(bo)破(po)碎(sui)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)（冰浴(yu)，功(gong)率(lv) 20％或 200W，超(chao)聲(sheng) 3s，間(jian)隔 10s，重(zhong)復 30 次(ci)）；8000g 4℃離心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置(zhi)冰上待測。

2、組織(zhi)：按照組織(zhi)質量(liang)（g）：提(ti)取(qu)液(ye)體積(ji)(ml)為 1：5~10 的(de)比例（建(jian)議稱取約(yue) 0.1g 組織(zhi)，加(jia)入 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)），進(jin)行(xing)冰浴(yu)勻(yun)漿(jiang)。8000g 4℃離心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置(zhi)冰上待測。

3、血清(qing)（漿(jiang)）樣(yang)品(pin)：直(zhi)接檢測。

測定(ding)步驟(zhou)：

1、分光(guang)光度計或(huo)酶(mei)標儀(yi)預(yu)熱 30min 以(yi)上，調(tiao)節(jie)波(bo)長至 340nm，蒸餾水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、樣(yang)本(ben)測(ce)定

在(zai)試劑(ji)二瓶(ping)中加(jia)入 17ml 試(shi)劑(ji)壹和(he) 1.13ml 蒸(zheng)餾水(shui)充(chong)分(fen)溶(rong)解，置(zhi)於 37℃（哺(bu)乳動物(wu)）或(huo) 25℃（其它(ta)物(wu)種(zhong)）水(shui)浴(yu) 5min；用(yong)不完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復凍融；

在(zai)試劑(ji)三中加(jia)入 1ml 蒸(zheng)餾水(shui)充(chong)分(fen)混(hun)勻，冰上放(fang)置(zhi)備用(yong)；用(yong)不完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復凍融；

在(zai)試劑(ji)四中加(jia)入 1ml 蒸(zheng)餾水(shui)充(chong)分(fen)混(hun)勻，冰上放(fang)置(zhi)待用(yong)；用(yong)不完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復凍融；

在(zai)微量(liang)石(shi)英(ying)比色皿或 96 孔(kong)板中加(jia)入 10μl 樣(yang)本(ben)、10μl 試(shi)劑(ji)三、10μl 試(shi)劑(ji)四和(he) 170μl 試(shi)劑(ji)二，混(hun)勻，立(li)即(ji)記錄 340nm 處 20s 時的吸光(guang)值(zhi)A1 和(he) 10min20s 後(hou)的(de)吸光(guang)值(zhi)A2，計(ji)算ΔA=A1-A2。

註意(yi)：不(bu)同勻漿(jiang)組織(zhi)中 PFK 活(huo)力(li)不壹(yi)樣(yang)，做正(zheng)式試驗(yan)之(zhi)前請做 1-2 只預(yu)試，若(ruo)ΔA>0.5，則(ze)說(shuo)明活(huo)力(li)太高(gao)，必須用(yong)提取(qu)液(ye)稀釋成(cheng)適(shi)當濃度勻漿(jiang)上清(qing)液(ye)（計算(suan)公式(shi)中乘以(yi)相(xiang)應稀釋倍數(shu)），或(huo)縮短(duan)反應時間(jian)至 2min 或 5min,使ΔA<0.5，以(yi)提高(gao)檢(jian)測(ce)靈敏(min)度。

PFK 活(huo)力(li)單位的(de)計算：

用(yong)微量(liang)石(shi)英(ying)比色皿測定的(de)計(ji)算(suan)公式(shi)如下：

1、血清(qing)（漿(jiang)）PFK 活(huo)力(li)的計(ji)算:

單位的(de)定義：每毫升血(xue)清(qing)（漿(jiang)）每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸(suan)和(he) 1nmolATP 轉(zhuan)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷(lin)酸(suan)和(he) 1nmol ADP 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣(yang)÷T=321×ΔA 2、組織(zhi)、細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)中 PFK 活(huo)力(li)計算(suan)：

按樣(yang)本(ben)蛋(dan)白濃(nong)度計算(suan)：

單位的(de)定義：每mg 組織(zhi)蛋白每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸(suan)和(he) 1nmolATP 轉(zhuan)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷(lin)酸(suan)和(he)1nmol ADP 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本(ben)鮮(xian)重(zhong)計算(suan)：

單位的(de)定義：每g 組織(zhi)每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸(suan)和(he) 1nmolATP 轉(zhuan)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷(lin)酸(suan)和(he) 1nmol ADP 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PFK（nmol/min /g 鮮重(zhong)）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=321×ΔA÷W

按細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)密度計算(suan)

單位的(de)定義：每 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸(suan)和(he) 1nmolATP 轉(zhuan)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷(lin)酸(suan)和(he) 1nmol ADP 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(2000×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=0.1605×ΔA

V 反總(zong)：反應(ying)體系(xi)總(zong)體積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消光系(xi)數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑(jing)，1cm； V 樣(yang)：加(jia)入樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提(ti)取(qu)液(ye)體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時間(jian)，10 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋(dan)白質(zhi)濃度，mg/ml；W：樣(yang)本(ben)質(zhi)量(liang)，g；2000：細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)總(zong)數，2000 萬(wan)。

用(yong) 96 孔(kong)板測定的計(ji)算(suan)公式(shi)如下：

1、血清(qing)（漿(jiang)）PFK 活(huo)力(li)的計(ji)算:

單位的(de)定義：每毫升血(xue)清(qing)（漿(jiang)）每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸(suan)和(he) 1nmolATP 轉(zhuan)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷(lin)酸(suan)和(he) 1nmol ADP 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PFK（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣(yang)÷T=642×ΔA 2、組織(zhi)、細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)中 PFK 活(huo)力(li)計算(suan)：

按樣(yang)本(ben)蛋(dan)白濃(nong)度計算(suan)：

單位的(de)定義：每mg 組織(zhi)蛋白每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸(suan)和(he) 1nmolATP 轉(zhuan)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷(lin)酸(suan)和(he)

1nmol ADP 定義(yi)為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PFK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=642×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本(ben)鮮(xian)重(zhong)計算(suan)

單位的(de)定義：每g 組織(zhi)每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸(suan)和(he) 1nmolATP 轉(zhuan)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷(lin)酸(suan)和(he) 1nmol ADP 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PFK（nmol/min /g 鮮重(zhong)）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=642×ΔA÷W

按細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)密度計算(suan)

單位的(de)定義：每 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)每分鐘催化 1nmol 果糖-6-磷酸(suan)和(he) 1nmolATP 轉(zhuan)化為 1nmol 果糖-1,6-二磷(lin)酸(suan)和(he) 1nmol ADP 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

PFK（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(2000×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=0.321×ΔA

V 反總(zong)：反應(ying)體系(xi)總(zong)體積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消光系(xi)數，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔(kong)板光徑(jing)，0.5cm； V 樣(yang)：加(jia)入樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提(ti)取(qu)液(ye)體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時間(jian)，10 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋(dan)白質(zhi)濃度，mg/ml；W：樣(yang)本(ben)質(zhi)量(liang)，g；2000：細(xi)菌或(huo)細(xi)胞(bao)總(zong)數，2000 萬(wan)。

果糖-6-磷酸(suan)激(ji)酶(mei)試劑(ji)盒 糖酵解(jie)