線(xian)粒體(ti)復(fu)合體Ⅳ又稱細(xi)胞se素(su)C 氧(yang)化酶，也是線(xian)粒體(ti)呼(hu)吸電(dian)子(zi)傳(chuan)遞(di)鏈主(zhu)路(lu)和(he)支路(lu)的共(gong)有(you)成(cheng)分(fen)，負(fu)責催化還原(yuan)型細(xi)胞se素(su)C 的(de)氧(yang)化，並最終把電(dian)子(zi)傳(chuan)遞(di)給(gei)氧，生成(cheng)水。
線(xian)粒體(ti)復(fu)合體Ⅳ試劑盒(he) 氧化磷酸化

線(xian)粒體(ti)復(fu)合體Ⅳ試劑盒(he)說明書(shu)

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)法 25 管/24 樣

線(xian)粒體(ti)復(fu)合體Ⅳ試劑盒(he) 氧化磷酸化

正(zheng)式測定(ding)前務必取 2-3 個預期(qi)差(cha)異較(jiao)大(da)的樣本(ben)做預測定(ding)測定(ding)意(yi)義(yi)：

線(xian)粒體(ti)復(fu)合體Ⅳ又稱細(xi)胞se素(su)C 氧(yang)化酶，也是線(xian)粒體(ti)呼(hu)吸電(dian)子(zi)傳(chuan)遞(di)鏈主(zhu)路(lu)和(he)支路(lu)的共(gong)有(you)成(cheng)分(fen)，負(fu)責催化還原(yuan)型細(xi)胞se素(su)C 的(de)氧化，並最終把電(dian)子(zi)傳(chuan)遞(di)給(gei)氧，生成(cheng)水。

測定(ding)原(yuan)理(li)：

還原(yuan)型細(xi)胞se素(su) C 在 550nm 有(you)特征(zheng)光(guang)吸(xi)收，線(xian)粒體(ti)復(fu)合體Ⅳ催化還原(yuan)型細(xi)胞se素(su) C 生成(cheng)氧化型細(xi)胞se素(su)C，因(yin)此(ci) 550nm 光(guang)吸(xi)收下(xia)降(jiang)速率(lv)能夠反(fan)映線(xian)粒體(ti)復(fu)合體Ⅳ酶活性(xing)。

試(shi)劑的組成和(he)配制(zhi)：

需(xu)自備(bei)的儀器和(he)用品：

可見(jian)分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、臺(tai)式離心機(ji)、水(shui)浴鍋、可調(tiao)式移液(ye)器、1mL 玻璃(li)比色(se)皿(min)、研(yan)缽(bo)、冰和(he)蒸餾(liu)水(shui)。

樣本(ben)的前處(chu)理(li)：

組(zu)織(zhi)、細(xi)菌或(huo)細(xi)胞中(zhong)胞(bao)漿(jiang)蛋白與(yu)線(xian)粒體(ti)蛋白的分離：

1、準(zhun)確(que)稱(cheng)取 0.1g 組織(zhi)或(huo)收集(ji) 500 萬(wan)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞，加(jia)入(ru) 1ml 試劑壹和(he) 10ul 試劑三(san)，用冰浴(yu)勻漿(jiang)器或(huo)研缽(bo)勻漿(jiang)。

2、將勻漿(jiang) 600g，4℃離心 5min。

3、棄(qi)沈澱，將上清(qing)液(ye)移至(zhi)另(ling)壹(yi)離心管中(zhong)，11000g，4℃離心 10min。

4、上(shang)清液(ye)即為(wei)除去線(xian)粒體(ti)的(de)胞(bao)漿(jiang)蛋白，可用於測定(ding)從線(xian)粒體(ti)泄(xie)漏(lou)的(de)復(fu)合體Ⅳ（此(ci)步可選做(zuo)）。

5、步驟(zhou) 4 中(zhong)的(de)沈澱即為(wei)線(xian)粒體(ti)，加(jia)入(ru) 200ul 試劑二和(he) 2uLl 試劑三(san)，超(chao)聲波破(po)碎(sui)（冰浴(yu)，功率(lv) 20％或(huo)200W，超(chao)聲 3s，間隔(ge) 10 秒，重復(fu) 30 次(ci)），用於復合體Ⅳ酶活性(xing)測定(ding)。

測定(ding)步驟(zhou)：

1、分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)預(yu)熱(re) 30min 以(yi)上(shang)，調(tiao)節波長至 550nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、樣本(ben)測定(ding)

工(gong)作液(ye)的配制(zhi)：臨用前取試劑四、試劑五(wu)、試(shi)劑六各(ge)壹(yi)支，將試劑五(wu)和(he)試劑六依次(ci)轉移(yi)到(dao)試劑四中(zhong)混(hun)合溶解(jie)；用不(bu)完的(de)試劑分裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反(fan)復凍(dong)融(rong)。

將工作(zuo)液(ye)置於(yu) 37℃（哺(bu)乳動(dong)物）或(huo) 25℃（其(qi)它物種(zhong)）孵(fu)育 5min；

在 1ml 玻璃(li)比色(se)皿(min)中(zhong)加(jia)入(ru) 80μl 樣本(ben)和(he) 800μl 工作(zuo)液(ye)，混勻，記(ji)錄 550nm 處(chu)初始(shi)吸光(guang)值(zhi) A1 和(he) 37℃

反(fan)應 30min 後(hou)的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)A2，計(ji)算ΔA=A1-A2。

註(zhu)意(yi)事項:

1、若(ruo)ΔA 大(da)於 0.2，需(xu)將樣本(ben)用試劑二稀(xi)釋適(shi)當倍數（計算公式中(zhong)乘以相(xiang)應稀(xi)釋倍數），使A1-A2 小(xiao)於(yu) 0.2，可提(ti)高(gao)檢(jian)測靈(ling)敏(min)度。

2、動(dong)物肝(gan)臟(zang)樣本(ben)由於酶(mei)活性(xing)過(guo)高(gao)， 1 分鐘內(nei)吸(xi)光(guang)值(zhi)就(jiu)會(hui)到(dao)達平(ping)臺(tai)期(qi)，務必先(xian)進(jin)行 2 個樣本(ben)的預測定(ding)。可將樣本(ben)用試劑二稀(xi)釋 10~50 倍，反(fan)應時(shi)間(jian)縮到(dao)到(dao) 30 秒或(huo) 1 分鐘（計(ji)算公式中(zhong)代入(ru)實(shi)際(ji)反(fan)應時(shi)間(jian)，並乘 以相(xiang)應稀(xi)釋倍數）。其(qi)他樣本(ben)可按照正(zheng)常(chang)測定(ding)步驟(zhou)進行(xing)。

復(fu)合體Ⅳ活力單(dan)位的計(ji)算：

按樣本(ben)蛋白濃(nong)度(du)計(ji)算

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組織(zhi)蛋白每(mei)分鐘(zhong)催化降(jiang)解(jie) 1 nmol 還原(yuan)型細(xi)胞se素(su)C 定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶活(huo)力單(dan)位。復合體Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr

此(ci)法需要(yao)自行(xing)測定(ding)樣本(ben)蛋白質濃(nong)度(du)。

按樣本(ben)鮮重計(ji)算

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei)g 組織(zhi)每(mei)分鐘(zhong)催化降(jiang)解(jie) 1nmol 還原(yuan)型細(xi)胞se素(su) C 定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶活(huo)力單(dan)位。

復(fu)合體Ⅳ活力(nmol/min/g 鮮(xian)重)=[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總(zong))÷T=3.88×ΔA÷W

按細(xi)菌或(huo)細(xi)胞密(mi)度計(ji)算

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬(wan)個細(xi)菌或(huo)細(xi)胞每(mei)分鐘(zhong)催化降(jiang)解(jie) 1nmol 還原(yuan)型細(xi)胞se素(su)C 定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶活(huo)力單(dan)位。復合體Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總(zong))÷T=0.008×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反(fan)應體(ti)系(xi)總(zong)體(ti)積，8.8×10-4 L；ε：細(xi)胞se素(su)C 摩(mo)爾(er)消光(guang)系(xi)數(shu)，1.91×104 L / mol /cm；d：比色(se)皿(min)光(guang)徑(jing)，1cm；V 樣：加(jia)入(ru)樣本(ben)體積，0.08 ml；V 樣總(zong)：加(jia)入(ru)提取液(ye)體積，0.202 ml；T：反(fan)應時(shi)間(jian)，30 min； Cpr：樣本(ben)蛋白質濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣本(ben)質量，g；500：細(xi)胞或(huo)細(xi)菌總(zong)數(shu)，500 萬(wan)。

線(xian)粒體(ti)復(fu)合體Ⅳ試劑盒(he) 氧化磷酸化