Na+K+-ATP 酶分(fen)解ATP 生(sheng)成(cheng)ADP 及無機(ji)磷，通(tong)過(guo)測(ce)定(ding)無機(ji)磷的量(liang)來確定(ding)ATP 酶活(huo)性。
試劑(ji)的組(zu)成和(he)配(pei)制：
Na+K+- ATP 酶活(huo)性測(ce)定(ding) 氧(yang)化磷酸化

Na+K+- ATP 酶活(huo)性測(ce)定(ding)說明書(shu)

分(fen)光(guang)光(guang)度法 50 管/24 樣

Na+K+- ATP 酶活(huo)性測(ce)定(ding) 氧(yang)化磷酸化

正(zheng)式測(ce)定(ding)前(qian)務必(bi)取(qu) 2-3 個(ge)預期(qi)差異(yi)較(jiao)大(da)的樣本做預測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意(yi)義：

Na⁺K⁺- ATP 酶廣(guang)泛分(fen)布(bu)於(yu)植(zhi)物(wu)、動物、微(wei)生(sheng)物(wu)和(he)細(xi)胞中(zhong)，可催化(hua)ATP 水解生(sheng)成(cheng)ADP 和(he)無機(ji)磷。

測(ce)定(ding)原(yuan)理(li)：

Na⁺K⁺-ATP 酶分(fen)解ATP 生(sheng)成(cheng)ADP 及無機(ji)磷，通(tong)過(guo)測(ce)定(ding)無機(ji)磷的量(liang)來確定(ding)ATP 酶活(huo)性。

試(shi)劑(ji)的組(zu)成和(he)配(pei)制：

試(shi)劑(ji)四：粉(fen)劑(ji)×3 支，-20℃保存。用(yong)時(shi)每(mei)支加(jia) 1ml 蒸餾水；用(yong)不完的(de)試劑(ji)分(fen)裝後-20℃保存，禁(jin)止反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)；

試(shi)劑(ji)七：粉(fen)劑(ji)×1 瓶, 4℃保存。用(yong)時(shi)加(jia)入 25ml 蒸(zheng)餾水，溶(rong)解後(hou) 4℃保存壹周(zhou)；試劑(ji)八：粉(fen)劑(ji)×1 瓶, 4℃保存。用(yong)時(shi)加(jia)入 25ml 蒸(zheng)餾水，溶(rong)解後(hou) 4℃保存壹周(zhou)；

0.5μmol/ml 標(biao)準磷應(ying)用(yong)液(ye)配(pei)制：將貯備液 20 倍(bei)稀釋，即(ji)取(qu) 0.1ml 試劑(ji)十加(jia) 1.9ml 蒸餾水充分(fen)混(hun)勻(yun)。

定(ding)磷劑(ji)的配(pei)制：按(an) H2O: 試劑(ji)七:試(shi)劑(ji)八:試(shi)劑(ji)九=2:1:1:1 的比(bi)例配(pei)制，配(pei)好的定(ding)磷劑(ji)應(ying)為淺(qian)黃色(se)。若無色(se)則(ze)試劑(ji)失(shi)效(xiao)，若(ruo)是(shi)藍色(se)則(ze)為磷汙染(ran)，定(ding)磷劑(ji)現用(yong)現(xian)配(pei)。

需(xu)自備的儀器和(he)用(yong)品(pin):

可見(jian)分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)、臺(tai)式離(li)心機(ji)、可調式移液器、1 ml 玻(bo)璃(li)比(bi)色(se)皿、研(yan)缽(bo)、冰(bing)和(he)蒸(zheng)餾水。

樣品(pin)酶液(ye)的制備：

1、細(xi)菌、細(xi)胞或(huo)組(zu)織樣品(pin)的(de)制(zhi)備：

細(xi)菌或(huo)培養細(xi)胞：先收(shou)集細(xi)菌或(huo)細(xi)胞到(dao)離(li)心管內，離(li)心後(hou)棄(qi)上清(qing)；按(an)照細(xi)菌或(huo)細(xi)胞數量(liang)（104 個(ge)）：提取(qu)液體(ti)積（ml）為 500~1000：1 的比(bi)例（建(jian)議(yi) 500 萬(wan)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞加(jia)入 1ml 提(ti)取(qu)液），超(chao)聲(sheng)波(bo)破碎細(xi)菌或(huo)細(xi)胞（冰(bing)浴，功(gong)率 20％或(huo) 200W，超(chao)聲(sheng) 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重復(fu) 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置冰(bing)上待測(ce)。

組(zu)織：按(an)照組織質量(liang)（g）：提取(qu)液體(ti)積(ml)為 1：5~10 的比(bi)例（建(jian)議(yi)稱(cheng)取(qu)約 0.1g 組(zu)織，加(jia)入 1ml 提(ti)取(qu)液），進行(xing)冰(bing)浴勻(yun)漿(jiang)。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置冰(bing)上待測(ce)。

2、血清(qing)（漿(jiang)）樣品(pin)：直接檢測(ce)。

操(cao)作步驟(zhou):

1、分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)預(yu)熱(re) 30min 以上，調節(jie)波(bo)長(chang)至(zhi) 660nm，蒸餾水調(tiao)零。

2、酶促(cu)反(fan)應(ying)（在EP 管中(zhong)加(jia)入下(xia)列(lie)試(shi)劑(ji)）：

混(hun)勻(yun)，37℃（哺(bu)乳(ru)動物）或(huo) 25℃（其(qi)他(ta)物(wu)種(zhong)）準確水浴(yu) 10min;

混(hun)勻(yun)，8000g，25℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)液(ye); 3、定(ding)磷(在 1.5mlEP 管中(zhong)依次加(jia)入下(xia)列(lie)試(shi)劑(ji))

混(hun)勻(yun)，室(shi)溫放(fang)置 30 min，在 660nm 處(chu)比(bi)色(se)。

註(zhu)意(yi):

1、由(you)於每(mei)壹個(ge)樣都必(bi)須(xu)做對(dui)照(zhao)，本試(shi)劑(ji)盒 50 管保證(zheng)測(ce) 24 份(fen)Na+K+-ATP 酶。

2、此法(fa)具有微(wei)量(liang)、靈敏(min)、快速(su)的特點。所(suo)以對(dui)測(ce)定(ding)所(suo)用(yong)試(shi)管要(yao)求(qiu)嚴(yan)格(ge)無磷。

3、空白(bai)管和(he)標(biao)準管只要(yao)做壹管。

計(ji)算(suan):

1、血清(qing)（漿(jiang)）Na+K+-     ATPase 活力(li)的計(ji)算(suan):

定(ding)義(yi)：每(mei)小(xiao)時(shi)每(mei)毫升(sheng)血清(qing)（漿(jiang)）中(zhong)Na+K+- ATP 酶分(fen)解ATP 產(chan)生(sheng) 1μmol 無機(ji)磷的量(liang)為壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單位。

Na+K+-ATP 酶活(huo)力（μmol/h/ml）=[C 標(biao)準管×V 總]×（A 測(ce)定(ding)管-A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標(biao)準管-A 空白(bai)管）÷V 樣÷T=7.5×（A 測(ce)定(ding)管-A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標(biao)準管-A 空白(bai)管）

2、組(zu)織、細(xi)菌或(huo)細(xi)胞中(zhong)Na+K+- ATPase 活力(li)的(de)計(ji)算(suan)：

按(an)蛋(dan)白(bai)濃度計(ji)算(suan)：

定(ding)義(yi)：每(mei)小(xiao)時(shi)每(mei)毫克(ke)組織蛋(dan)白(bai)中(zhong) Na+K+- ATP 酶分(fen)解ATP 產(chan)生(sheng) 1μmol 無機(ji)磷的量(liang)為壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單位。

Na+K+-ATP 酶活(huo)力(μmol/h /mg)= [C 標(biao)準管×V 總]×（A 測(ce)定(ding)管-A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標(biao)準管-A 空白(bai)管）÷（Cpr×V 樣）÷T =7.5×（A 測(ce)定(ding)管-A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標(biao)準管-A 空白(bai)管）÷Cpr

按(an)樣本鮮重計(ji)算(suan)：

定(ding)義(yi)：每(mei)小(xiao)時(shi)每(mei)克組(zu)織中(zhong)Na+K+-ATP 酶分(fen)解ATP 產(chan)生(sheng) 1μmol 無機(ji)磷的量(liang)為壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單位。

Na+K+-ATP 酶活(huo)力(μmol/h/g)= [C 標(biao)準管×V 總]×（A 測(ce)定(ding)管-A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標(biao)準管-A 空白(bai)管）÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=7.5×（A 測(ce)定(ding)管-A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標(biao)準管-A 空白(bai)管）÷W

按(an)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞密(mi)度計(ji)算(suan)：

定(ding)義(yi)：每(mei)小(xiao)時(shi)每(mei) 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞中(zhong)Na+K+-ATP 酶分(fen)解ATP 產(chan)生(sheng) 1μmol 無機(ji)磷的量(liang)為壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單位。

Na+K+-ATP 酶活(huo)力(μmol/h /104)= [C標(biao)準管×V總]×（A 測(ce)定(ding)管-A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標(biao)準管-A 空白(bai)管）÷(500×V樣÷V 樣總)÷T=0.015×（A 測(ce)定(ding)管-A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標(biao)準管-A 空白(bai)管）

C 標(biao)準管：標(biao)準管濃(nong)度，0.5μmol/ml；V 總：酶促(cu)反(fan)應(ying)總體(ti)積，0.5ml；V 樣：加(jia)入樣本體積，0.2ml ； V 樣總：加(jia)入提(ti)取(qu)液體(ti)積，1ml；T：反應(ying)時間，1/6 小(xiao)時(shi)；Cpr：樣本蛋(dan)白(bai)質濃(nong)度，mg/ml；W：樣本鮮重， g；500：細(xi)菌或(huo)細(xi)胞總數(shu)，500 萬(wan)。

Na+K+- ATP 酶活(huo)性測(ce)定(ding) 氧(yang)化磷酸化