根據(ju)Ca++ Mg++-ATP 酶(mei)分(fen)解(jie) ATP 生(sheng)成ADP 及(ji)無(wu)機磷(lin)，通(tong)過(guo)測(ce)定無(wu)機磷(lin)的(de)量(liang)來(lai)確(que)定ATP 酶(mei)活(huo)性高低(di)。
Ca++ Mg++- ATP 酶(mei)活(huo)性測(ce)定 氧化磷(lin)酸(suan)化系(xi)列(lie)

Ca++ Mg++- ATP 酶活性測(ce)定說明(ming)書

分(fen)光光(guang)度(du)法(fa) 50 管/24 樣(yang)

Ca++ Mg++- ATP 酶活性測(ce)定 氧化磷(lin)酸(suan)化系(xi)列(lie)

正(zheng)式測(ce)定前(qian)務必取(qu) 2-3 個預期(qi)差(cha)異較大(da)的(de)樣(yang)本(ben)做(zuo)預測(ce)定測(ce)定意義：

Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶廣(guang)泛(fan)分(fen)布(bu)於(yu)植物(wu)、動物(wu)、微(wei)生(sheng)物(wu)和細胞中，可催(cui)化ATP水解(jie)生(sheng)成ADP 和無(wu)機磷(lin)。

測(ce)定原(yuan)理：

根據(ju)Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶分(fen)解(jie) ATP 生(sheng)成ADP 及(ji)無(wu)機磷(lin)，通(tong)過(guo)測(ce)定無(wu)機磷(lin)的(de)量(liang)來(lai)確(que)定ATP 酶活性高低(di)。

試劑(ji)的(de)組(zu)成和配制(zhi)：

試劑(ji)四：粉劑(ji)×3 支，-20℃保存。用時(shi)每支加 1ml 蒸(zheng)餾水(shui)，現(xian)用現(xian)配；用不(bu)完(wan)的(de)試劑(ji)分(fen)裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存，禁止反復凍融(rong)；

試劑(ji)六：粉劑(ji)×1 瓶，4℃保存。用時(shi)加入(ru) 3ml 蒸(zheng)餾水(shui)， 4℃保(bao)存(cun)；

試劑(ji)七(qi)：粉(fen)劑(ji)×1 瓶, 4℃保存。用時(shi)加入(ru) 25ml 蒸(zheng)餾水(shui)，溶(rong)解(jie)後(hou) 4℃保(bao)存壹周；試劑(ji)八(ba)：粉(fen)劑(ji)×1 瓶, 4℃保存。用時(shi)加入(ru) 25ml 蒸(zheng)餾水(shui)，溶(rong)解(jie)後(hou) 4℃保(bao)存壹周；

0.5μmol/ml 標準(zhun)磷應用液配制(zhi)：將(jiang)試劑(ji)十 20 倍稀釋，即(ji)取(qu) 0.1ml 試劑(ji)十加 1.9ml 蒸(zheng)餾水(shui)充(chong)分(fen)混勻(yun)；定(ding)磷(lin)劑(ji)的(de)配制(zhi)：按(an) H2O: 試(shi)劑(ji)七(qi):試(shi)劑(ji)八(ba):試(shi)劑(ji)九=2:1:1:1 的(de)比例配制(zhi)，配好的(de)定磷劑(ji)應為(wei)淺黃色(se)。若無(wu)色(se)則試(shi)劑(ji)失(shi)效，若是(shi)藍(lan)色(se)則為(wei)磷汙染(ran)，定(ding)磷劑(ji)現用現(xian)配。

註(zhu)意：配試(shi)劑(ji)最好用新(xin)的(de)燒杯(bei)、玻(bo)棒和玻璃移液器，也(ye)可以(yi)用壹次性塑(su)料器(qi)皿(min)，避免磷汙染(ran)。

需自備的(de)儀器及(ji)用品(pin):

可見(jian)分(fen)光光(guang)度(du)計(ji)、水浴鍋(guo)、臺(tai)式離(li)心(xin)機(ji)、可調式移液器、1ml 玻璃比(bi)色(se)皿(min)、研缽、冰(bing)和蒸餾水(shui)。

樣(yang)品酶液的(de)制備：

1、細菌、細(xi)胞或(huo)組(zu)織(zhi)樣(yang)品的(de)制備：

細菌或(huo)培養細(xi)胞：先收(shou)集細菌或(huo)細胞到(dao)離(li)心(xin)管(guan)內，離(li)心(xin)後(hou)棄上(shang)清(qing)；按(an)照細菌或(huo)細胞數量(liang)（104 個）：提(ti)取(qu)液體積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比例（建議 500 萬(wan)細菌或(huo)細胞加入(ru) 1ml 提(ti)取(qu)液），超(chao)聲(sheng)波(bo)破碎(sui)細(xi)菌或(huo)細胞（冰浴，功(gong)率 20％或(huo) 200W，超(chao)聲(sheng) 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清(qing)，置(zhi)冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

組(zu)織(zhi)：按(an)照組(zu)織(zhi)質量(liang)（g）：提(ti)取(qu)液體積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的(de)比例（建議稱(cheng)取(qu)約 0.1g 組(zu)織(zhi)，加入(ru) 1ml 提(ti)取(qu)液），進行冰浴(yu)勻(yun)漿。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清(qing)，置(zhi)冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

2、血清（漿）樣(yang)品：直(zhi)接(jie)檢(jian)測(ce)。

操(cao)作步驟：

1、分(fen)光光(guang)度(du)計(ji)預熱 30min 以(yi)上(shang)，調節(jie)波(bo)長至(zhi) 660nm，蒸(zheng)餾水(shui)調零；

2、加樣(yang)表(在 1.5ml 棕色(se)EP 管中按(an)下(xia)表依次加樣(yang)）；

混勻(yun)，37℃（哺(bu)乳(ru)動(dong)物(wu)）或(huo) 25℃（其他物(wu)種）準(zhun)確(que)水浴(yu) 10min

混勻(yun)，8000g，25℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清(qing)液 3 定磷（1.5mlEP 管中(zhong)依次加入(ru)下(xia)列(lie)試(shi)劑(ji)）

混勻(yun)，室(shi)溫(wen)放置(zhi) 30 min，在 660nm 處(chu)比色(se)。

註(zhu)意事項：

1、由於(yu)每壹個樣(yang)都必(bi)須做(zuo)對照，本(ben)試(shi)劑(ji)盒(he) 50 管只能測(ce) 24 份Ca++ Mg++-ATP 酶(mei)。

2、此法(fa)具(ju)有微(wei)量(liang)、靈敏、快(kuai)速的(de)特點(dian)。所(suo)以對測(ce)定所(suo)用試(shi)管(guan)要(yao)求嚴(yan)格(ge)無(wu)磷。避(bi)免磷汙染(ran)是(shi)檢(jian)測(ce)成敗的(de)關鍵(jian)。

3、空白(bai)管和標準(zhun)管只要(yao)做(zuo)壹管。

計算(suan)：

1、血清（漿）Ca++ Mg++-  ATPase 活(huo)力的(de)計算(suan):

定義：規(gui)定(ding)每(mei)小時(shi)每毫升血清（漿）中(zhong) Ca++ Mg++- ATP 酶分(fen)解(jie)ATP 產生(sheng) 1μmol 無(wu)機磷(lin)的(de)量(liang)為(wei)壹個酶活力單(dan)位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(li)（μmol /h/ mL）=[ C 標準(zhun)管×V 總]×（A 測(ce)定管(guan)-A 對照管）÷（A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）÷V 樣(yang)÷T=7.5×（A 測(ce)定管(guan)-A 對照管）÷（A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）

組(zu)織(zhi)中Ca++ Mg++-  ATPase 的(de)計算(suan)：

2、組(zu)織(zhi)、細菌或(huo)細胞中Ca++ Mg++-      ATPase 活力(li)的(de)計算(suan)：

按(an)蛋(dan)白(bai)濃(nong)度計算(suan)：

定義：每(mei)小時(shi)每毫克(ke)組(zu)織(zhi)蛋白(bai)中 Ca++ Mg++- ATP 酶分(fen)解(jie)ATP 產生(sheng) 1μmol 無(wu)機磷(lin)的(de)量(liang)為(wei)壹個酶活力單(dan)位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(li)(μmol/h/mg)=[C 標準(zhun)管×V 總]×（A 測(ce)定管(guan)-A 對照管）÷（A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）÷（V 樣(yang)×Cpr）÷T =7.5×（A 測(ce)定管(guan)-A 對照管）÷（A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）÷Cpr

按(an)樣(yang)本(ben)鮮(xian)重計算(suan)：

定義：每(mei)小時(shi)每克(ke)組(zu)織(zhi)中Ca++ Mg++-ATP 酶(mei)分(fen)解(jie)ATP 產生(sheng) 1μmol 無(wu)機磷(lin)的(de)量(liang)為(wei)壹個酶活力單(dan)位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(li)(μmol/h/g)= [C 標準(zhun)管×V 總]×（A 測(ce)定管(guan)-A 對照管）÷（A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T=7.5×（A 測(ce)定管(guan)-A 對照管）÷（A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）÷W

按(an)細(xi)菌或(huo)細胞密度計(ji)算(suan)：

定義：規(gui)定(ding)每(mei)小時(shi)每 1 萬個細(xi)菌或(huo)細胞中 Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶分(fen)解(jie)ATP 產生(sheng) 1μmol 無(wu)機磷(lin)的(de)量(liang)為(wei)壹個酶活力單(dan)位。

Ca⁺⁺ Mg++-ATP 酶活力(li)(μmol/h /10⁴)= [C 標準(zhun)管×V 總]×（A 測(ce)定管(guan)-A 對照管）÷（A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T=0.015×（A 測(ce)定管(guan)-A 對照管）÷（A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）

C 標準(zhun)管：標準(zhun)管濃(nong)度，0.5μmol/mL；V 總：酶促(cu)反應(ying)總(zong)體積(ji)，0.5mL；V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.2mL ； V 樣(yang)總：加入(ru)提(ti)取(qu)液體積(ji)，1mL；T：反應(ying)時(shi)間，1/6 小時(shi)；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)質濃(nong)度，mg/mL；W：樣(yang)本(ben)鮮(xian) 重，g；500：細菌或(huo)細胞總數，500 萬(wan)。

Ca++ Mg++- ATP 酶活性測(ce)定 氧化磷(lin)酸(suan)化系(xi)列(lie)