NADH 和NADPH 均在 340nm 有(you)特(te)征吸收(shou)，因(yin)此(ci)TH 催(cui)化的轉氫(qing)反應(ying)不能(neng)導致 340nm 吸(xi)光(guang)度發生變化。用(yong)人工(gong)合成(cheng)底物(wu) 3-乙(yi)酰吡(bi)啶腺(xian)嘌(piao)呤二核(he)苷酸磷(lin)酸（APADP+）替(ti)代NADP+，TH-1 催(cui)化 APADP+還原生成(cheng)的APADPH 在 375nm 有(you)特(te)征光吸(xi)收(shou)，因(yin)此(ci)通過測(ce)定(ding) 375nm 光(guang)吸(xi)收(shou)增(zeng)加速(su)率，來(lai)計(ji)算 TH-1 活(huo)性(xing)。
線(xian)粒(li)體轉氫(qing)酶(mei)-1 TH-1試(shi)劑(ji)盒(he) 氧(yang)化磷酸化

線粒(li)體轉(zhuan)氫酶(mei)-1（TH-1）試劑(ji)盒說(shuo)明書

分(fen)光光(guang)度法 50 管/48 樣(yang)

線粒(li)體轉(zhuan)氫酶(mei)-1 TH-1試(shi)劑(ji)盒(he) 氧(yang)化磷酸化

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前務必取(qu) 2-3 個(ge)預期(qi)差異(yi)較大的(de)樣(yang)本(ben)做預測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意義：

TH 位於線粒(li)體(ti)的內膜上，又稱(cheng)為呼(hu)吸(xi)電子傳(chuan)遞(di)鏈(lian)復(fu)合(he)體(ti)六，催(cui)化 NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH相互轉化。催(cui)化正(zheng)向(xiang)反應(ying)稱(cheng)為 TH-1。線粒(li)體 NADH 含(han)量增(zeng)加時(shi)會(hui)導致線(xian)粒(li)體膜的(de)H+電化學梯(ti)度升(sheng)高(gao)，因(yin)而(er)促進(jin)了(le)電子傳(chuan)遞(di)鏈(lian)上ROS 的產生。TH-1 促(cu)進NADH 轉(zhuan)換為NADPH，從而(er)提高(gao)線(xian)粒(li)體(ti)的(de)抗氧(yang)化能力。

測(ce)定(ding)原(yuan)理(li)：

NADH 和NADPH 均在 340nm 有(you)特(te)征吸收(shou)，因(yin)此(ci)TH 催(cui)化的轉氫(qing)反應(ying)不能(neng)導致 340nm 吸光(guang)度發生變化。用(yong)人工(gong)合成(cheng)底物(wu) 3-乙(yi)酰吡(bi)啶腺(xian)嘌(piao)呤二核(he)苷酸磷(lin)酸（APADP⁺）替(ti)代NADP⁺，TH-1 催(cui)化 APADP⁺還原生成(cheng)的APADPH 在 375nm 有(you)特(te)征光吸(xi)收(shou)，因(yin)此(ci)通過測(ce)定(ding) 375nm 光(guang)吸(xi)收(shou)增(zeng)加速(su)率，來(lai)計(ji)算 TH-1 活(huo)性(xing)。

試劑(ji)的組(zu)成(cheng)和配制：

需自(zi)備的儀(yi)器(qi)和用(yong)品(pin)：

可見分(fen)光光(guang)度計(ji)、臺(tai)式(shi)離心機(ji)、水浴鍋、可(ke)調式移(yi)液器(qi)、1mL 玻(bo)璃比(bi)色(se)皿、研缽(bo)、冰(bing)和蒸餾水。

樣本(ben)的前處理(li)：

組(zu)織(zhi)、細菌或細胞(bao)中(zhong)胞(bao)漿(jiang)蛋白與(yu)線(xian)粒(li)體蛋白的(de)分(fen)離：

1、準(zhun)確(que)稱(cheng)取 0.1g 組(zu)織(zhi)或收(shou)集(ji) 500 萬細菌或細胞(bao)，加入 1mL 試(shi)劑(ji)壹，用(yong)冰浴(yu)勻漿(jiang)器(qi)或研缽(bo)勻(yun)漿(jiang)。

2、將勻(yun)漿(jiang) 600g，4℃離心 5min。

3、棄沈(chen)澱(dian)，將上清(qing)液移至(zhi)另(ling)壹離心管中(zhong)，11000g，4℃離心 10min。

4、上清(qing)液即(ji)為除(chu)去(qu)線(xian)粒(li)體(ti)的胞(bao)漿(jiang)蛋白，可(ke)用(yong)於測(ce)定(ding)從(cong)線(xian)粒體泄漏(lou)的TH-1（此(ci)步(bu)可選做）。

5、步驟(zhou) 4 中(zhong)的沈(chen)澱(dian)即(ji)為線(xian)粒體(ti)，加入 500uL 試(shi)劑(ji)二，超(chao)聲波破碎（冰(bing)浴，功率 20％或 200W，超(chao)聲3s，間(jian)隔(ge) 10 秒(miao)，重(zhong)復(fu) 30 次），用(yong)於TH-1 活(huo)性(xing)測(ce)定(ding)。

測(ce)定(ding)步(bu)驟(zhou)：

1、分(fen)光光(guang)度計(ji)預熱(re) 30min 以上，調節波(bo)長至(zhi) 375nm，蒸(zheng)餾水調零。

2、樣本(ben)測(ce)定(ding)

工作(zuo)液的配制：臨(lin)用(yong)前取試(shi)劑(ji)三、試(shi)劑(ji)四(si)和試劑(ji)五各壹支(zhi)，將試(shi)劑四、五轉移(yi)到(dao)試(shi)劑(ji)三(san)中(zhong)混合(he)溶(rong)解(jie)，置於 37℃（哺乳動(dong)物(wu)）或 25℃（其(qi)它(ta)物(wu)種(zhong)）水浴 5min；用(yong)不完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分(fen)裝後(hou)-20℃保存，禁(jin)止(zhi)反復凍(dong)融(rong)。

在 1mL 玻(bo)璃比(bi)色(se)皿中(zhong)加入 100μL 樣(yang)本(ben)和 1000μL 工作(zuo)液，混勻(yun)，立(li)即(ji)記(ji)錄(lu) 375nm 處初(chu)始(shi)吸光(guang)值(zhi)A1 和 10min 後的(de)吸光(guang)值(zhi)A2，計(ji)算ΔA=A2-A1。

TH-1 活(huo)性(xing)計(ji)算：

按(an)樣(yang)本(ben)蛋白濃(nong)度計(ji)算

單位的定(ding)義：每(mei)mg 組(zu)織(zhi)蛋白每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生 1 nmol APADPH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活(huo)性(xing)單(dan)位。

TH-1 活(huo)性(xing)（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣)÷T=164×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本(ben)鮮(xian)重(zhong)計(ji)算

單位的定(ding)義：每(mei)g 組(zu)織(zhi)每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生 1 nmol APADPH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活(huo)性(xing)單(dan)位。

TH-1 活(huo)性(xing)（nmol/min/g 鮮(xian)重(zhong)）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣(yang)總×W) ÷T=82×ΔA÷W

按(an)細菌或細胞(bao)密(mi)度計(ji)算

單位的定(ding)義：每(mei) 1 萬個(ge)細菌或細胞(bao)每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生 1 nmol APADPH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活(huo)性(xing)單(dan)位。

TH-1 活(huo)性(xing)（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣(yang)總×500) ÷T=0.164×ΔA

V 反總：反應(ying)體系(xi)總體積(ji)，1.1×10-3 L；ε：APADPH 摩(mo)爾消(xiao)光系(xi)數，6.7×103 L / mol /cm；d：比色(se)皿光徑(jing)，1cm；V 樣：加入樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.1 mL；V 樣(yang)總：加入提(ti)取(qu)液體積(ji)，0.5mL；T：反應(ying)時(shi)間(jian)，10 min； Cpr：樣本(ben)蛋白質(zhi)濃(nong)度，mg/mL；W：樣(yang)本(ben)質量(liang)，g；500：細菌或細胞(bao)總數，500 萬。

線粒(li)體轉(zhuan)氫酶(mei)-1 TH-1試(shi)劑(ji)盒(he) 氧(yang)化磷酸化