TH 位(wei)於(yu)線粒(li)體的內膜上，又(you)稱(cheng)為(wei)線粒體復合體六，催化(hua)NADH+NADP+和NAD++NADPH 相互(hu)轉化，調(tiao)節線(xian)粒(li)體NAD(H)和NADP(H)平衡。把(ba)逆(ni)向反(fan)應稱(cheng)為(wei) TH-2，催化(hua) NADPH 和NAD+生(sheng)成NADP+和NADH。
線粒體轉氫酶-2 TH-2試(shi)劑(ji)盒(he) 氧化磷(lin)酸(suan)化

線(xian)粒(li)體轉氫酶-2（TH-2）試(shi)劑(ji)盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

分(fen)光(guang)光(guang)度法(fa) 50 管/48 樣(yang)

線粒(li)體轉氫酶-2 TH-2試(shi)劑(ji)盒(he) 氧化磷(lin)酸(suan)化

正(zheng)式(shi)測定(ding)前務必取(qu) 2-3 個預期(qi)差異較(jiao)大的(de)樣(yang)本(ben)做(zuo)預測定(ding)測定(ding)意(yi)義：

TH 位(wei)於(yu)線粒(li)體的內膜上，又(you)稱(cheng)為(wei)線粒體復合體六，催化(hua)NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH 相互(hu)轉化，調(tiao)節線(xian)粒(li)體NAD(H)和NADP(H)平衡。把(ba)逆(ni)向反(fan)應稱(cheng)為(wei) TH-2，催化(hua) NADPH 和NAD⁺生(sheng)成NADP⁺和NADH。

測(ce)定(ding)原理(li)：

NADH 和NADPH 均(jun)在(zai) 340nm 有(you)特征(zheng)吸(xi)收，因此TH 催化(hua)的轉氫反(fan)應不(bu)能導(dao)致(zhi) 340nm 吸(xi)光(guang)度發生(sheng)變(bian)化(hua)。用(yong)人(ren)工合(he)成底物 3-乙(yi)酰(xian)吡(bi)啶腺(xian)嘌呤(ling)二核(he)苷(gan)酸(suan)（APAD⁺）替代(dai) NAD⁺，TH-2 催化(hua)APAD⁺還原生(sheng)成APADH， APADH 在 375nm 有(you)特征(zheng)光(guang)吸(xi)收，測定(ding) 375nm 光(guang)吸(xi)收的增加速(su)率(lv)，來(lai)計(ji)算 TH-2 活(huo)性。

試(shi)劑(ji)的(de)組(zu)成(cheng)和配制：

需(xu)自(zi)備的儀器(qi)和用品：

可見(jian)分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)、臺式(shi)離(li)心(xin)機、水浴鍋(guo)、可調(tiao)式(shi)移液器(qi)、1mL 玻(bo)璃比色(se)皿(min)、研(yan)缽、冰(bing)和蒸(zheng)餾水(shui)。

樣(yang)本(ben)的(de)前(qian)處理(li)：

組(zu)織、細(xi)菌或細(xi)胞中(zhong)胞(bao)漿(jiang)蛋白(bai)與線(xian)粒體蛋白(bai)的分(fen)離(li)：

1、準(zhun)確稱取(qu) 0.1g 組(zu)織或收(shou)集(ji) 500 萬細(xi)菌或細(xi)胞，加入(ru) 1mL 試(shi)劑(ji)壹(yi)，用(yong)冰(bing)浴勻(yun)漿(jiang)器(qi)或研(yan)缽勻(yun)漿(jiang)。

2、將(jiang)勻(yun)漿(jiang) 600g，4℃離(li)心(xin) 5min。

3、棄(qi)沈(chen)澱(dian)，將(jiang)上清(qing)液移至另壹(yi)離(li)心(xin)管中，11100g，4℃離(li)心(xin) 10min。

4、上清(qing)液即為(wei)除去(qu)線(xian)粒體的胞漿蛋(dan)白(bai)，可用(yong)於(yu)測定(ding)從線粒(li)體泄漏(lou)的TH-2（此步(bu)可選(xuan)做(zuo)）。

5、步驟 4 中(zhong)的沈(chen)澱(dian)即為(wei)線粒體，加入(ru) 500uL 試(shi)劑(ji)二，超聲波破碎(sui)（冰(bing)浴，功(gong)率(lv) 20％或 200W，超聲3s，間(jian)隔 10 秒，重(zhong)復 30 次(ci)），用於(yu)TH-2 活性(xing)測(ce)定(ding)。

測定(ding)步驟：

1、 分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)預熱 30min 以上，調(tiao)節波長(chang)至(zhi) 375nm，蒸(zheng)餾水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、 樣(yang)本(ben)測(ce)定(ding)

工作液的配制：臨(lin)用(yong)前(qian)取(qu)試(shi)劑(ji)三(san)、試(shi)劑(ji)四(si)和試(shi)劑(ji)五各壹(yi)支，將(jiang)試(shi)劑(ji)四(si)、五轉移到試(shi)劑(ji)三(san)中(zhong)混合溶解(jie)，置於(yu) 37℃（哺(bu)乳動(dong)物）或 25℃（其(qi)它物種）水浴 5min；用(yong)不(bu)完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分(fen)裝後-20℃保存，禁(jin)止(zhi)反(fan)復凍(dong)融。

在(zai) 1mL 玻(bo)璃比色(se)皿(min)中加入(ru) 100μL 樣(yang)本(ben)和 1000μL 工作液，混勻(yun)，立(li)即記錄(lu) 375nm 處初始吸(xi)光(guang)值A1 和 10min 後的吸(xi)光(guang)值A2，計(ji)算ΔA=A2-A1。

TH-2 活性(xing)計(ji)算：

按樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)濃度計(ji)算

單位(wei)的定(ding)義：每(mei)mg 組(zu)織蛋(dan)白(bai)每分(fen)鐘(zhong)產生(sheng) 1 nmol APADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

TH-2 活(huo)性(xing)（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr)÷T=164×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本(ben)鮮(xian)重(zhong)計(ji)算

單位(wei)的定(ding)義：每(mei)g 組(zu)織每(mei)分(fen)鐘(zhong)產生(sheng) 1 nmol APADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

TH-2 活(huo)性(xing)（nmol/min/g 鮮(xian)重(zhong)）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總) ÷T=82×ΔA÷W

按細(xi)菌或細(xi)胞密度計(ji)算

單位(wei)的定(ding)義：每(mei) 1 萬個細(xi)菌或細(xi)胞每(mei)分(fen)鐘(zhong)產生(sheng) 1 nmol APADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

TH-2 活(huo)性(xing)（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總) ÷T=0.164×ΔA

V 反(fan)總：反(fan)應體系總體積(ji)，1.1×10-3L；ε：APADH 摩(mo)爾消(xiao)光(guang)系(xi)數(shu)，6.7×103 L / mol /cm；d：比色(se)皿(min)光(guang)徑(jing)，1cm；V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.1mL；V 樣(yang)總：加入(ru)提取(qu)液體積(ji)，0.5mL；T：反(fan)應時(shi)間(jian)，10 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃(nong)度，mg/mL；W：樣(yang)本(ben)質(zhi)量(liang)，g；500：細(xi)菌或細(xi)胞總數(shu)，500 萬。

線(xian)粒(li)體轉氫酶-2 TH-2試(shi)劑(ji)盒(he) 氧化磷(lin)酸(suan)化