PEPCK 催化(hua)草(cao)xian乙酸生成(cheng)磷酸(suan)烯(xi)醇(chun)式(shi)丙(bing)酮酸(suan)和(he)CO2，丙(bing)tong酸激酶(mei)和(he)乳酸(suan)脫氫酶(mei)進(jin)壹(yi)步(bu)依次(ci)催化(hua) NADH氧(yang)化(hua)生(sheng)成(cheng)NAD+，在(zai) 340nm 下測定NADH 下(xia)降(jiang)速率(lv)，即(ji)可反映 PEPCK 活性(xing)。
磷酸(suan)烯(xi)醇(chun)式(shi)丙(bing)*酸羧(suo)激酶(mei)試劑盒 糖異(yi)生(sheng)系列

磷酸(suan)烯(xi)醇(chun)式(shi)丙(bing)*酸羧(suo)激酶(mei)（PEPCK)試劑盒說明(ming)書(shu)

微量法(fa) 100 管(guan)/96 樣

磷酸(suan)烯(xi)醇(chun)式(shi)丙(bing)*酸羧(suo)激酶(mei)試劑盒 糖異(yi)生(sheng)系列

正式(shi)測定前(qian)務(wu)必取 2-3 個(ge)預期差異較大(da)的(de)樣本做預測定測定意義：

PEPCK（EC 4.1.1.32）廣泛存在(zai)於動(dong)物(wu)、植物(wu)、微生物(wu)和(he)細(xi)胞(bao)中(zhong)，催化(hua)草(cao)xian乙酸轉化(hua)為(wei)磷酸(suan)烯(xi)醇(chun)式(shi)丙(bing)酮酸(suan)，是(shi)調節(jie)糖異(yi)生(sheng)途(tu)徑的(de)關(guan)鍵(jian)酶(mei)。

測定原(yuan)理(li)：

PEPCK 催(cui)化(hua)草(cao)xian乙酸生成(cheng)磷酸(suan)烯(xi)醇(chun)式(shi)丙(bing)酮酸(suan)和(he)CO2，丙(bing)tong酸激酶(mei)和(he)乳酸(suan)脫氫酶(mei)進(jin)壹(yi)步(bu)依次(ci)催化(hua) NADH氧(yang)化(hua)生(sheng)成(cheng)NAD⁺，在(zai) 340nm 下(xia)測定NADH 下(xia)降(jiang)速(su)率(lv)，即(ji)可反映 PEPCK 活性(xing)。

組(zu)成(cheng)：

自(zi)備(bei)儀(yi)器和(he)用品(pin)：

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)/酶(mei)標(biao)儀(yi)、臺式(shi)離(li)心機、可調(tiao)式(shi)移液器、微量石(shi)英比(bi)色皿(min)/96 孔(kong)板、研缽、冰(bing)和(he)蒸(zheng)餾水。

樣(yang)本(ben)的(de)前處(chu)理(li)：

1、細(xi)菌(jun)或培(pei)養細(xi)胞(bao)：先收集(ji)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)到(dao)離(li)心管(guan)內(nei)，離(li)心後棄(qi)上清(qing)；按照(zhao)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)數量(liang)（104 個(ge)）：提取(qu)液體積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比例（建(jian)議(yi) 500 萬細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)加入 1ml 提取(qu)液），超聲波(bo)破(po)碎(sui)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)（冰(bing)浴，功(gong)率(lv) 20％或(huo) 200W，超(chao)聲 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重(zhong)復(fu) 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心 10min，取上(shang)清(qing)，置冰(bing)上待(dai)測。

2、組(zu)織(zhi)：按照組(zu)織(zhi)質(zhi)量（g）：提取(qu)液體積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的(de)比例（建(jian)議(yi)稱取(qu)約(yue) 0.1g 組織(zhi)，加入 1ml 提取(qu)液），進行(xing)冰(bing)浴勻(yun)漿。8000g 4℃離(li)心 10min，取上(shang)清(qing)，置冰(bing)上待(dai)測。

3、血清（漿）樣(yang)品(pin)：直(zhi)接(jie)檢(jian)測。

測定步(bu)驟：

1、分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)或酶(mei)標(biao)儀(yi)預熱 30min 以上，調(tiao)節(jie)波長(chang)至(zhi) 340nm，蒸(zheng)餾水調(tiao)零。

2、工(gong)作液的(de)配制(zhi)：臨用前(qian)將(jiang)試劑二和(he)試劑三轉(zhuan)移(yi)到(dao)試劑壹中(zhong)混合溶解(jie)待(dai)用(yong)；用(yong)不完的(de)試劑分裝後-20℃保存，禁止反復(fu)凍融。

3、試劑四的(de)配制(zhi)：臨用前(qian)加(jia)入 1ml 蒸(zheng)餾水充(chong)分溶(rong)解(jie)待(dai)用(yong)；用(yong)不完的(de)試劑分裝後-20℃保存，禁止反復(fu)凍融。

4、將(jiang)工(gong)作液和(he)試劑四置於 37℃(哺乳(ru)動(dong)物(wu))或 25℃(其(qi)它(ta)物(wu)種)預熱 5 分(fen)鐘(zhong)。

5、在(zai)微量石(shi)英比(bi)色皿(min)或 96 孔(kong)板中(zhong)加入 10μl 樣本(ben)、10μl 試劑四和(he) 180μl 工(gong)作液，立即混勻(yun)，記(ji)錄 340nm處(chu)初始吸光(guang)值(zhi)A1 和(he) 1min 後的(de)吸光(guang)值(zhi)A2，計(ji)算(suan)ΔA=A1-A2。

註意：在(zai)該試劑盒中(zhong)，若ΔA 大(da)於 0.1，需將樣(yang)本(ben)用提取(qu)液稀釋適(shi)當(dang)倍(bei)數後測定，使ΔA 小於 0.1 可提高(gao)檢(jian)測靈敏(min)度。計(ji)算(suan)公(gong)式中(zhong)乘(cheng)以相應(ying)稀釋(shi)倍(bei)數。

PEPCK 活性(xing)計(ji)算(suan)：

用(yong)微量石(shi)英比(bi)色皿(min)測定的(de)計(ji)算(suan)公(gong)式如下(xia)

1、血清（漿）PEPCK 活力(li)計(ji)算(suan)

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)毫(hao)升血清（漿）每(mei)分鐘消(xiao)耗 1 nmol NADH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

PEPCK（nmol/min/ml））＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣(yang)÷T=3215×ΔA 2、組織(zhi)、細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)中(zhong) PEPCK 活力(li)計(ji)算(suan)

按(an)樣(yang)本(ben)蛋白(bai)濃度(du)計(ji)算(suan)

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei) mg 組(zu)織(zhi)蛋白(bai)每(mei)分(fen)鐘消(xiao)耗 1nmol NADH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本(ben)鮮(xian)重計(ji)算(suan)

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei) g 組(zu)織(zhi)每分鐘(zhong)消(xiao)耗 1 nmol NADH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

PEPCK（nmol/min/g 鮮(xian)重）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣總)÷T=3215×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)密度計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬個(ge)細(xi)胞(bao)每分鐘消(xiao)耗 1 nmol NADH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

PEPCK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣總)÷T=6.43×ΔA

V 反總(zong)：反應(ying)體系總體積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消(xiao)光(guang)系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色(se)皿(min)光(guang)徑，1cm； V 樣：加(jia)入樣本(ben)體積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總：加入提取(qu)液體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時間(jian)，1 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白(bai)質(zhi)濃度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量，g；500：細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)總數，500 萬。

用(yong) 96 孔(kong)板測定的(de)計(ji)算(suan)公(gong)式如下(xia)

1、血清（漿）PEPCK 活力(li)計(ji)算(suan)

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)毫(hao)升血清（漿）每(mei)分鐘消(xiao)耗 1 nmol NADH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

PEPCK（nmol/min/ml））＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣(yang)÷T=6430×ΔA 2、組織(zhi)、細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)中(zhong) PEPCK 活力(li)計(ji)算(suan)

按(an)樣(yang)本(ben)蛋白(bai)濃度(du)計(ji)算(suan)

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei) mg 組(zu)織(zhi)蛋白(bai)每(mei)分(fen)鐘消(xiao)耗 1nmol NADH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本(ben)鮮(xian)重計(ji)算(suan)

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei) g 組(zu)織(zhi)每分鐘(zhong)消(xiao)耗 1 nmol NADH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

PEPCK（nmol/min/g 鮮(xian)重）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣總)÷T=6430×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)密度計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬個(ge)細(xi)胞(bao)每分鐘消(xiao)耗 1 nmol NADH 定(ding)義為(wei)壹個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

PEPCK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣總)÷T=12.86×ΔA

V 反總(zong)：反應(ying)體系總體積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消(xiao)光(guang)系數，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔(kong)板光(guang)徑，0.5cm； V 樣(yang)：加(jia)入樣本(ben)體積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總：加入提取(qu)液體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時間(jian)，1 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白(bai)質(zhi)濃度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量，g；500：細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)總數，500 萬。

磷酸(suan)烯(xi)醇(chun)式(shi)丙(bing)*酸羧(suo)激酶(mei)試劑盒 糖異(yi)生(sheng)系列