基於肉堿和脂酰輔mei A 在丙(bing)二酰輔mei A 存(cun)在與(yu)否的條件(jian)下，通過(guo)肉堿脂酰轉(zhuan)移酶(CPT-I)的作用，產生(sheng)脂酰肉堿，並(bing)釋(shi)放出巰基輔mei A(COA-SH)，與(yu)Ellman 試劑(ji)DN-TB 反應後(hou)，產生(sheng)黃(huang)色的(de) TNB。通過(guo)其吸收(shou)峰值(zhi)得(de)變化(hua)（412nm），來(lai)定(ding)量分析CPT-1 的(de)活性(xing)。
肉毒(du)堿棕櫚(lv)酰(xian)轉(zhuan)移酶CPT-1試劑(ji)盒(he) 脂肪酸系(xi)列(lie)

肉毒(du)堿棕櫚(lv)酰(xian)轉(zhuan)移酶（CPT-1）試劑(ji)盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

微(wei)量法(fa) 100 管/96 樣(yang)

肉毒(du)堿棕櫚(lv)酰(xian)轉(zhuan)移酶CPT-1試劑(ji)盒(he) 脂肪酸系(xi)列(lie)

測定(ding)意(yi)義：

肉毒(du)堿棕櫚(lv)酰(xian)轉(zhuan)移酶是存(cun)在於(yu)線粒(li)體(ti)內膜(mo)的壹(yi)類(lei)酰(xian)基轉(zhuan)移酶。可逆地催(cui)化從(cong)酰基輔mei A 將酰(xian)基轉(zhuan)移至L-肉毒(du)堿的反應，在轉(zhuan)運脂肪酸通過(guo)線粒(li)體(ti)內膜(mo)的過(guo)程(cheng)中起(qi)重要作用。

測定(ding)原(yuan)理(li)：

基於肉堿和脂酰輔mei A 在丙(bing)二酰輔mei A 存(cun)在與(yu)否的條件(jian)下，通過(guo)肉堿脂酰轉(zhuan)移酶(CPT-I)的作用，產生(sheng)脂酰肉堿，並(bing)釋(shi)放出巰基輔mei A(COA-SH)，與(yu)Ellman 試劑(ji)DN-TB 反應後(hou)，產生(sheng)黃(huang)色的(de) TNB。通過(guo)其吸收(shou)峰值(zhi)得(de)變化(hua)（412nm），來(lai)定(ding)量分析CPT-1 的(de)活性(xing)。

組成(cheng)：

自(zi)備(bei)儀(yi)器和用(yong)品：

可見分光(guang)光(guang)度計/酶(mei)標儀(yi)、臺式離(li)心機、水浴鍋(guo)、可調(tiao)式移液(ye)器、微(wei)量石(shi)英比色皿(min)/96 孔(kong)板、研(yan)缽、冰(bing)、無水(shui)乙(yi)醇和蒸(zheng)餾水

樣(yang)本的前(qian)處理(li)：

組織(zhi)、細菌(jun)或(huo)細胞(bao)中(zhong)胞漿(jiang)蛋白與線粒(li)體(ti)蛋白的分離：

稱(cheng)取約(yue) 0.1g 組織或收(shou)集 500 萬細胞(bao)，加(jia)入 1ml 試(shi)劑(ji)壹(yi)和 10μl 試(shi)劑(ji)三(san)，用冰浴勻(yun)漿(jiang)器或(huo)研(yan)缽勻(yun)漿(jiang)。將(jiang)勻(yun)漿(jiang)液(ye)於(yu) 600g，4℃離(li)心(xin) 5min。

棄沈(chen)澱(dian)，將上清(qing)液(ye)移至另(ling)壹(yi)離(li)心(xin)管(guan)中，11000g，4℃離心 10min。

上清(qing)液(ye)即胞漿(jiang)提取物(wu)，可用於測定(ding)從(cong)線粒(li)體(ti)泄(xie)漏的 CPT-1（此(ci)步可選(xuan)做(zuo)）。

在步(bu)驟(zhou)④的(de)沈(chen)澱(dian)中加(jia)入(ru) 200μl 試(shi)劑(ji)二和 2μl 試(shi)劑(ji)三(san)，超(chao)聲波(bo)破碎（冰浴，功(gong)率(lv) 20％或(huo) 200W，超(chao)聲 3 秒(miao)，間隔 10 秒(miao)，重復(fu) 30 次(ci)），用於(yu)線粒(li)體(ti) CPT-1 測(ce)定(ding)。

測定(ding)步(bu)驟(zhou)：

1、分光(guang)光(guang)度計或(huo)酶標儀(yi)預(yu)熱 30min 以(yi)上，調(tiao)節(jie)波長至 412nm，蒸餾水調(tiao)零。

2、樣(yang)本測定(ding)

在試(shi)劑(ji)五(wu)中(zhong)加(jia)入 1ml 無水乙(yi)醇，混勻(yun)，再(zai)加入 22ml 試劑(ji)四(si)，混勻(yun)，37℃（哺(bu)乳動物(wu)）或 25℃（其它物(wu)種(zhong)）孵育(yu) 5min；用不(bu)完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分裝(zhuang)後(hou)-20℃保存(cun)，禁止反復(fu)凍(dong)融(rong)；

在試(shi)劑(ji)六(liu)中加入(ru) 1ml 蒸餾水，混(hun)勻(yun)，37℃（哺乳動(dong)物(wu)）或(huo) 25℃（其(qi)它(ta)物(wu)種(zhong)）孵育(yu) 5min；用不(bu)完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分裝(zhuang)後(hou)-20℃保存(cun)，禁止反復(fu)凍(dong)融(rong)；

在微(wei)量石(shi)英比色皿(min)或(huo) 96 孔(kong)板中(zhong)加(jia)入(ru) 10μl 樣(yang)本、220μl 試劑(ji)五(wu)和 10μl 試(shi)劑(ji)六(liu)，混勻，記錄(lu) 412nm 處20 秒(miao)時(shi)的初始吸光(guang)度A1 和 2 分 20 秒(miao)時(shi)的吸光(guang)度A2，計算(suan)ΔA=A2-A1。

CPT-1 活性(xing)計算(suan)：

使用(yong)微(wei)量石(shi)英比色皿(min)測(ce)定(ding)的(de)計算公(gong)式(shi)如(ru)下：

按樣(yang)本蛋白濃(nong)度計算：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組織蛋白每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1 nmol TNB 定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶活力(li)單位(wei)。 CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr此(ci)法需(xu)要自(zi)行(xing)測(ce)定(ding)樣(yang)本蛋白質(zhi)濃(nong)度。

按樣(yang)本鮮重計算：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei)g 組織每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1 nmol TNB 定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶活力(li)單位(wei)。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總）÷T=177.8×ΔA÷W

按細菌(jun)或(huo)細胞(bao)密(mi)度計(ji)算：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬個細菌(jun)或(huo)細胞(bao)每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1 nmol TNB 定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶活力(li)單位(wei)。

CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總）÷T=0.3556×ΔA

V 反總：反應體(ti)系(xi)總體(ti)積(ji)，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩(mo)爾消光(guang)系(xi)數，1.36×104 L / mol /cm；d：比(bi)色皿(min)光(guang)徑，1cm； V 樣(yang)：加(jia)入(ru)樣(yang)本體(ti)積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總：加入(ru)提取液(ye)體(ti)積(ji)，0.202 ml；T：反應時(shi)間，2 min；Cpr：樣(yang)本蛋白質(zhi)濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量，g；500：細胞(bao)或(huo)細菌(jun)總數，500 萬。

使用(yong) 96 孔板測(ce)定(ding)的(de)計算公(gong)式(shi)如(ru)下：

按樣(yang)本蛋白濃(nong)度計算：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組織蛋白每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1 nmol TNB 定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶活力(li)單位(wei)。 CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr此(ci)法需(xu)要自(zi)行(xing)測(ce)定(ding)樣(yang)本蛋白質(zhi)濃(nong)度。

按樣(yang)本鮮重計算：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei)g 組織每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1 nmol TNB 定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶活力(li)單位(wei)。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總）÷T=355.6×ΔA÷W

按細菌(jun)或(huo)細胞(bao)密(mi)度計(ji)算：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬個細菌(jun)或(huo)細胞(bao)每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1 nmol TNB 定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶活力(li)單位(wei)。

CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總）÷T=0.711×ΔA

V 反總：反應體(ti)系(xi)總體(ti)積(ji)，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩(mo)爾消光(guang)系(xi)數，1.36×104 L / mol /cm；d：96 孔(kong)板光(guang)徑，0.5cm； V 樣(yang)：加(jia)入(ru)樣(yang)本體(ti)積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總：加入(ru)提取液(ye)體(ti)積(ji)，0.202 ml；T：反應時(shi)間，2 min；Cpr：樣(yang)本蛋白質(zhi)濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量，g；500：細胞(bao)或(huo)細菌(jun)總數，500 萬。

肉毒(du)堿棕櫚(lv)酰(xian)轉(zhuan)移酶CPT-1試劑(ji)盒(he) 脂肪酸系(xi)列(lie)