二磷酸核(he)酮(tong)糖羧(suo)化(hua)酶(mei)（EC 4.1.1.39）是植(zhi)物光(guang)合作用中的壹(yi)個(ge)關鍵(jian)酶(mei)，既控制著CO2 的固(gu)定(ding)，同(tong)時(shi)又(you)制約著(zhe)碳(tan)素向Calvin 循環和(he)光呼吸循環分流(liu)，其(qi)活性(xing)的大小(xiao)直(zhi)接(jie)影響著光(guang)合速率(lv)。
二(er)磷(lin)酸核(he)酮(tong)糖羧(suo)化(hua)酶(mei)試劑盒 光合系(xi)列

二磷酸核(he)酮(tong)糖羧(suo)化(hua)酶(mei)（Rubisco）試劑盒

分光光度法

二磷酸核(he)酮(tong)糖羧(suo)化(hua)酶(mei)試劑盒 光合系(xi)列

正(zheng)式測(ce)定(ding)前(qian)務(wu)必(bi)取(qu) 2-3 個(ge)預期(qi)差(cha)異較大的樣本做(zuo)預測定(ding)測(ce)定(ding)意(yi)義(yi)：

二磷酸核(he)酮(tong)糖羧(suo)化(hua)酶(mei)（EC 4.1.1.39）是植(zhi)物光(guang)合作用中的壹(yi)個(ge)關鍵(jian)酶(mei)，既控制著CO2 的固(gu)定(ding)，同(tong)時(shi)又(you)制約著(zhe)碳(tan)素向Calvin 循環和(he)光呼吸循環分流(liu)，其(qi)活性(xing)的大小(xiao)直(zhi)接(jie)影響著光(guang)合速率(lv)。

測定(ding)原(yuan)理(li)：

（1）在Rubisco 的催化(hua)下(xia)，1 分子(zi)的核酮(tong)糖-1，5-二(er)磷(lin)酸（RuBP）與 1 分子(zi)的CO2 結合，產(chan)生(sheng) 2 分子(zi)的 3-磷酸甘油酸（PGA）；（2）PGA 可(ke)通(tong)過(guo)外(wai)加(jia)的 3-磷酸甘油酸激(ji)酶(mei)和(he)甘油醛(quan)-3-磷酸脫氫(qing)酶(mei)的作用，產(chan)生(sheng)甘油醛(quan)-3-磷酸，伴隨著NADH 氧化(hua)生(sheng)成NAD+；（3）在 340 nm NADH 有特(te)征(zheng)吸收峰，而(er)NAD+沒(mei)有此吸(xi)收峰，因(yin)此測(ce)定(ding) 340nm 吸光度下(xia)降(jiang)速率(lv)可(ke)以代(dai)表Rubisco 的羧化(hua)酶(mei)活性(xing)。

組成：

BU6005-25T/24S 試劑二(er)：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，-20℃保(bao)存(cun)；臨(lin)用前加(jia)入 12.5ml 試劑壹(yi)，充分(fen)混勻待用；用不(bu)完(wan)的BU6005-25T/24S 試劑分(fen)裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復凍(dong)融(rong)；

BU6005-25T/24S 試劑三：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，-20℃保(bao)存(cun)；臨(lin)用前加(jia)入 12.5ml 試劑壹(yi)，充分(fen)混勻待用；用不(bu)完(wan)的試劑分(fen)裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復凍(dong)融(rong)；

BU6005-25T/24S 試劑四(si)：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，-20℃保(bao)存(cun)；臨(lin)用前加(jia)入 1.25 ml 試劑壹(yi)，充分(fen)溶解待用；用不(bu)完(wan)的試劑分(fen)裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復凍(dong)融(rong)；

BU6005-50T/48S 試劑二(er)：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，-20℃保(bao)存(cun)；臨(lin)用前加(jia)入 25ml 試劑壹(yi)，充分(fen)混勻待用；用不(bu)完(wan)的試劑分(fen)裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復凍(dong)融(rong)；

BU6005-50T/48S 試劑三：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，-20℃保(bao)存(cun)；臨(lin)用前加(jia)入 25ml 試劑壹(yi)，充分(fen)混勻待用；用不(bu)完(wan)的試劑分(fen)裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復凍(dong)融(rong)；

BU6005-50T/48S 試劑四(si)：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，-20℃保(bao)存(cun)；臨(lin)用前加(jia)入 2.5 ml 試劑壹(yi)，充分(fen)溶解待用；用不(bu)完(wan)的試劑分(fen)裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復凍(dong)融(rong)；

（註意(yi)：試劑二(er)、三、四(si)溶(rong)解後(hou)，按需(xu)分(fen)裝-20℃保(bao)存(cun)。）自備(bei)儀器(qi)和(he)用品(pin)：

可(ke)見(jian)-紫(zi)外(wai)分(fen)光(guang)光(guang)度計、臺式離(li)心機、水浴鍋、可(ke)調(tiao)式移(yi)液(ye)器(qi)、1ml 石(shi)英(ying)比(bi)色皿(min)、研(yan)缽、冰(bing)和(he)蒸餾(liu)水(shui)。

粗酶(mei)液(ye)制備：

①總 Rubisco 酶(mei)提取：建(jian)議(yi)稱(cheng)取(qu)約(yue) 0.1g 樣本，加(jia)入 1ml 提取液(ye)壹(yi)，冰浴勻漿後(hou)超聲破(po)碎（冰(bing)浴，200W，破碎 3s，間歇(xie) 7s，總時(shi)間(jian) 1min），然後 4℃，8000g 離(li)心 10min，取上清測(ce)定(ding)。

②胞漿(jiang)和(he)葉綠(lv)體Rubisco 酶(mei)的分離(li)：按照(zhao)植(zhi)物組(zu)織(zhi)質(zhi)量（g）：提取液(ye)體積(ml)為 1：5～10 的比(bi)例(li)（建(jian)議(yi)稱(cheng)取(qu)約(yue) 0.1g 樣本，加(jia)入 1ml 提取液(ye)壹(yi)），冰浴勻漿後(hou)於 4℃，200g 離(li)心 5min，棄沈澱(dian)，取(qu)上(shang)清(qing)在 4℃， 8000g 離心 10min，取上清用於測(ce)定(ding)胞漿(jiang) Rubisco 酶(mei)活性(xing)，取沈澱(dian)加(jia) 1ml 提取液(ye)二(er)，震(zhen)蕩溶解後(hou)超聲破(po)碎（冰(bing)浴，200W，破碎 3s，間歇(xie) 7s，總時(shi)間(jian) 1min），然後 4℃，8000g 離(li)心 10min，取上清測(ce)定(ding)葉綠(lv)體中Rubisco 酶(mei)活性(xing)。

建(jian)議(yi)測(ce)定(ding)總Rubisco 酶(mei)活性(xing)，按照(zhao)步驟(zhou)①提取粗(cu)酶(mei)液(ye)，若(ruo)需(xu)要(yao)分(fen)別測定(ding)胞漿(jiang)和(he)葉綠(lv)體中的Rubisco，則按(an)步驟(zhou)②提取粗(cu)酶(mei)液(ye)。

（照(zhao)註(zhu)意(yi)：粗酶(mei)液(ye)制備過(guo)程(cheng)中(zhong)超聲破(po)碎操(cao)作使(shi)用細胞破(po)碎儀(yi)進行。）測(ce)定(ding)步驟(zhou)：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(tiao)節波(bo)長(chang)至(zhi) 340nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調(tiao)零。

2、樣本測定(ding)

工作(zuo)液(ye)的配制：臨(lin)用前將(jiang)試劑二(er)和(he)試劑三 1：1 混(hun)合，用多(duo)少(shao)配多(duo)少(shao)；

在 1ml 石(shi)英(ying)比(bi)色皿(min)中(zhong)加(jia)入 50ul 樣本、50ul 試劑四(si)和(he) 900ul 工作(zuo)液(ye)，混(hun)勻，立(li)即記(ji)錄(lu) 340nm 處(chu) 20s

時(shi)吸(xi)光(guang)值(zhi)A1 和(he) 5min20s 時(shi)的吸光(guang)值(zhi)A2，計算(suan)ΔA=A1-A2。

Rubisco 活性(xing)計算(suan)：

1、按樣本蛋白濃(nong)度(du)計算(suan)

單(dan)位的定(ding)義(yi)：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧(yang)化(hua) 1 n mol NADH。

Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr 此法需(xu)要(yao)測(ce)定(ding)粗(cu)酶(mei)液(ye)中(zhong)蛋白質(zhi)濃(nong)度(du)，建(jian)議(yi)選購(gou)本公司生產(chan)的BCA 蛋白質(zhi)濃(nong)度(du)測定(ding)試劑盒。 2、按樣(yang)本鮮重(zhong)計算(suan)

單(dan)位的定(ding)義(yi)：25℃中 1 g 組(zu)織(zhi) 1 min 氧(yang)化(hua) 1 nmol NADH。

Rubisco（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T=643×ΔA÷W

上述計算(suan)公式(shi)中各符(fu)合含(han)義(yi)：

V 反總：反應(ying)體系(xi)總體積，1×10-3 L；ε：NADH 摩爾(er)消光(guang)系(xi)數，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色皿(min)光(guang)徑(jing)，1cm； V 樣：加(jia)入樣本體積，0.05 ml；V 樣總：加(jia)入提取液(ye)體積，1ml；T：反應(ying)時(shi)間(jian)，5 min；W：樣(yang)本質量，g。

二磷酸核(he)酮(tong)糖羧(suo)化(hua)酶(mei)試劑盒 光合系(xi)列