3-磷酸甘(gan)油酸激酶催化三(san)磷(lin)酸甘(gan)油酸和 ATP 生(sheng)成(cheng) 1,3 二(er)磷(lin)酸甘(gan)油酸。GAPDH 逆向(xiang)催化 1,3 二(er)磷(lin)酸甘(gan)油酸和NADH 生(sheng)成(cheng) 3 磷酸甘(gan)油醛、無(wu)機磷和 NAD，340nm 處(chu)測(ce)定(ding)NADH 的(de)減少量可(ke)反映GADPH 活性的(de)高(gao)低。
3-磷酸甘(gan)油醛脫氫(qing)酶試(shi)劑(ji)盒 光合(he)系(xi)列

3-磷(lin)酸甘(gan)油醛脫氫(qing)酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)試(shi)劑(ji)盒說明書

分光(guang)光度(du)法

3-磷(lin)酸甘(gan)油醛脫氫(qing)酶試(shi)劑(ji)盒 光合(he)系(xi)列

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前務(wu)必(bi)取(qu) 2-3 個預(yu)期差異(yi)較大的(de)樣本做(zuo)預測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意義：

GAPDH 催(cui)化 3-磷(lin)酸甘(gan)油醛氧化生(sheng)成(cheng) 1,3-二(er)磷(lin)酸甘(gan)油酸，是(shi)糖(tang)酵解(jie)途(tu)徑(jing)的(de)關鍵酶，與糖(tang)異(yi)生(sheng)途(tu)徑(jing)、體內(nei)血糖(tang)濃(nong)度(du)的(de)維(wei)持和糖(tang)尿病(bing)的(de)發(fa)生(sheng)密(mi)切(qie)相(xiang)關，在(zai)機體糖(tang)、脂(zhi)、蛋(dan)白(bai)代謝紊(wen)亂(luan)疾(ji)病中發揮重要(yao)作(zuo)用。

測(ce)定(ding)原理(li)：

3-磷(lin)酸甘(gan)油酸激酶催化三(san)磷(lin)酸甘(gan)油酸和 ATP 生(sheng)成(cheng) 1,3 二(er)磷(lin)酸甘(gan)油酸。GAPDH 逆向(xiang)催化 1,3 二(er)磷(lin)酸甘(gan)油酸和NADH 生(sheng)成(cheng) 3 磷酸甘(gan)油醛、無(wu)機磷和 NAD，340nm 處(chu)測(ce)定(ding)NADH 的(de)減少量可(ke)反映GADPH 活性的(de)高(gao)低。

組成(cheng)：

自(zi)備(bei)儀器和用品：

分光(guang)光度(du)計、恒溫(wen)水(shui)浴(yu)鍋、臺(tai)式離(li)心(xin)機、可(ke)調(tiao)式移液器(qi)、1 ml 石(shi)英(ying)比(bi)色皿、研缽(bo)、冰和蒸餾(liu)水(shui)。

組織(zhi)樣本的(de)前處(chu)理(li):

①總(zong)GAPDH 酶提取：建(jian)議稱(cheng)取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液(ye)壹(yi)，冰浴勻漿(jiang)後超(chao)聲破碎(sui)（冰浴，200W，破碎(sui) 3s，間歇 7s，總(zong)時間 1min），然(ran)後 4℃，8000g 離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清測(ce)定(ding)。

②胞(bao)漿(jiang)和葉(ye)綠體 GAPDH 酶的(de)分離(li)：按(an)照(zhao)植物(wu)組織(zhi)質量（g）：提取液(ye)體積(ml)為 1：5～10 的(de)比(bi)例(li)（建(jian)議稱(cheng)取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液(ye)壹(yi)），冰浴勻漿(jiang)後於(yu) 4℃，200g 離(li)心(xin) 5min，棄(qi)沈澱(dian)，取(qu)上(shang)清在(zai) 4℃， 8000g 離(li)心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清用於(yu)測(ce)定(ding)胞(bao)漿(jiang) GAPDH 酶活性，取沈(chen)澱(dian)加 1ml 提取液(ye)二(er)，震蕩(dang)溶解(jie)後超(chao)聲破碎(sui)（冰浴，200W，破碎(sui) 3s，間歇 7s，總(zong)時間 1min），然(ran)後 4℃，8000g 離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清測(ce)定(ding)葉(ye)綠體中 GAPDH 酶活性。

建(jian)議測(ce)定(ding)總(zong)GAPDH 酶活性，按(an)照(zhao)步(bu)驟(zhou)①提取粗(cu)酶液，若需要(yao)分別測(ce)定(ding)胞(bao)漿(jiang)和葉(ye)綠體中的(de) GAPDH，則按(an)照(zhao)步(bu)驟(zhou)②提取粗(cu)酶液。

細(xi)菌(jun)或培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)的(de)前處(chu)理(li):

先(xian)收(shou)集細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)到離(li)心(xin)管內(nei)，離(li)心(xin)後棄(qi)上(shang)清；按(an)照(zhao)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)數(shu)量（10⁴ 個）：提取液(ye)壹(yi)體積（ml）為 500~1000：1 的(de)比(bi)例(li)（建(jian)議 500 萬細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)加入 1ml 提取液(ye)壹(yi)），超(chao)聲波(bo)破碎(sui)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)（冰浴，功率(lv) 20％或 200W，超(chao)聲(sheng) 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重復 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清，置(zhi)冰上(shang)待測(ce)。

測(ce)定(ding)步(bu)驟(zhou):

1、分光(guang)光度(du)計預熱(re) 30min 以(yi)上(shang)，調節波長至(zhi) 340nm，蒸餾(liu)水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、樣本測(ce)定(ding)

工(gong)作(zuo)液的(de)配(pei)制：將(jiang)試(shi)劑(ji)二(er)全(quan)部(bu)倒入試(shi)劑(ji)壹(yi)瓶(ping)中，充分溶(rong)解(jie)，37℃(哺乳動物)或(huo) 25℃(其(qi)它物種)預熱(re) 10 分鐘；用不完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分裝(zhuang)後-20℃保(bao)存，禁(jin)止反復凍融(rong)。

在(zai)試(shi)劑(ji)三(san)中加入 500μL 蒸餾(liu)水(shui)，充(chong)分混(hun)勻待(dai)用；用不完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分裝(zhuang)後-20℃保(bao)存，禁(jin)止反復凍融(rong)。

在(zai) 1ml 石(shi)英(ying)比(bi)色皿中加入 30μL 樣本、20μL 試(shi)劑(ji)三(san)和 950μL 工(gong)作(zuo)液，混勻，加入最後壹(yi)個試(shi)劑(ji)的(de)同時開始(shi)計時，記錄(lu) 340nm 處(chu) 20s 時的(de)吸(xi)光值A1 和 5min20s 後的(de)吸(xi)光值A2，計(ji)算ΔA=A1-A2。

GAPDH 活(huo)性計算:

按(an)樣本蛋(dan)白(bai)濃度計算

單(dan)位的(de)定(ding)義：每(mei)mg 組織(zhi)蛋(dan)白(bai)每分鐘消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為壹(yi)個酶活力單(dan)位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

按(an)樣本鮮(xian)重計(ji)算

單(dan)位的(de)定(ding)義：每(mei)g 組織(zhi)每分鐘消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為壹(yi)個酶活力單(dan)位。

GAPDH（nmol/min /g 鮮(xian)重）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總(zong)) ÷T=1072×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)計(ji)算

單(dan)位的(de)定(ding)義：每(mei)壹(yi)萬(wan)個細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)每(mei)分鐘消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為壹(yi)個酶活力單(dan)位。

GAPDH（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(500 ×V 樣÷V 樣總(zong)) ÷T=2.144×ΔA

V 反總(zong)：反應(ying)體系(xi)總(zong)體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩(mo)爾(er)消(xiao)光(guang)系(xi)數，6.22×10³ L / mol /cm；d：比(bi)色皿光徑(jing)，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.03 ml；V 樣總(zong)：加入提取液(ye)體積，1 ml；T：反應(ying)時間，5 min；Cpr：樣本蛋(dan)白(bai)質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)總(zong)數(shu)，500 萬。

3-磷(lin)酸甘(gan)油醛脫氫(qing)酶試(shi)劑(ji)盒 光合(he)系(xi)列