MDHAR 催(cui)化(hua)MDHA 還原生(sheng)成(cheng)AsA，在抗壞(huai)血(xue)酸氧(yang)化(hua)還原代謝中(zhong)具(ju)有(you)重(zhong)要作用(yong)。
單脫(tuo)氫抗壞(huai)血(xue)酸還原酶試劑(ji)盒(he)

單(dan)脫氫抗壞(huai)血(xue)酸還原酶（monodehydroasorbate reductase，MDHAR）試劑(ji)盒(he)說(shuo)明書(shu)

分光(guang)光(guang)度(du)法(fa) 50 管(guan)/48 樣(yang)

單(dan)脫氫抗壞(huai)血(xue)酸還原酶試劑(ji)盒(he)

正(zheng)式測定前(qian)務必取(qu) 2-3 個(ge)預(yu)期(qi)差(cha)異較(jiao)大的(de)樣(yang)本做預(yu)測定測定意(yi)義(yi)：

MDHAR 催(cui)化(hua)MDHA 還原生(sheng)成(cheng)AsA，在(zai)抗壞(huai)血(xue)酸氧(yang)化(hua)還原代謝中(zhong)具(ju)有(you)重(zhong)要作用(yong)。

測定原理：

MDHAR 催(cui)化(hua) NADH 還原MDHA 生(sheng)成(cheng) AsA 和(he)NAD⁺，NADH 在(zai) 340 nm 有特征(zheng)吸(xi)收峰，但是 NAD⁺沒(mei)有(you)。通過測定 340 nm 光(guang)吸(xi)收下(xia)降(jiang)速率，來計(ji)算(suan)出 MDHAR 活(huo)性(xing)。

組(zu)成(cheng)：

試劑(ji)三(san)：粉劑(ji)×1 瓶（棕色(se)），4℃保存(cun)。臨用(yong)前(qian)加入(ru) 5ml 蒸(zheng)餾水(shui)充(chong)分溶解(jie)。試劑(ji)四(si)：粉劑(ji)×1 瓶，4℃保存(cun)。臨用(yong)前(qian)加入(ru) 5ml 蒸(zheng)餾水(shui)充(chong)分溶解(jie)。

試劑(ji)五：液體(ti) 25μl×1 瓶(ping)，4℃保(bao)存(cun)。臨用(yong)前(qian)加 5ml 試劑(ji)二(er)充(chong)分溶解(jie)。

自(zi)備儀(yi)器和(he)用(yong)品：

研(yan)缽、冰、臺式離心機(ji)、紫(zi)外(wai)分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)、1ml 石(shi)英比(bi)色(se)皿、可(ke)調(tiao)式移液槍(qiang)和(he)雙(shuang)蒸(zheng)水(shui)

粗(cu)酶液提取(qu)：

組(zu)織(zhi)：按(an)照(zhao)組(zu)織(zhi)質(zhi)量(liang)（g）：試劑(ji)壹(yi)體(ti)積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的(de)比(bi)例(li)（建議稱(cheng)取(qu)約 0.1g 組(zu)織(zhi)，加入(ru) 1ml 試劑(ji)壹(yi)）進(jin)行冰浴勻(yun)漿(jiang)。8000g，4℃離心(xin) 10min，取(qu)上清置冰上待測。

. 細(xi)菌、真(zhen)菌：按(an)照(zhao)細(xi)胞(bao)數量(liang)（104 個(ge)）：試劑(ji)壹(yi)體(ti)積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比(bi)例(li)（建議 500 萬細(xi)胞(bao)加入(ru) 1ml 試劑(ji)壹(yi)），冰浴超(chao)聲波破碎(sui)細(xi)胞(bao)（功(gong)率(lv) 300w，超(chao)聲 3 秒(miao)，間(jian)隔 7 秒(miao)，總(zong)時間(jian) 3min）；8000g ，4℃離心(xin) 20min，取(qu)上清液置冰上混(hun)勻待測。

血(xue)清等(deng)液體(ti)：直(zhi)接(jie)測定。

MDHAR 測定操作：

分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)預(yu)熱(re) 30 min，調(tiao)節(jie)波長到 340 nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調(tiao)零(ling)。

試劑(ji)二(er)在(zai) 25℃水(shui)浴鍋(guo)中(zhong)預熱(re) 30 min。

依次(ci)在(zai)比(bi)色(se)皿中(zhong)加入(ru) 100μl 試劑(ji)三(san)、100μl 試劑(ji)四(si)、100μl 試劑(ji)五和(he) 600μl 試劑(ji)二(er)，最後(hou)加入(ru) 100μl 上(shang)清液，迅速混(hun)勻後於(yu) 340nm 比(bi)色(se)，記(ji)錄(lu) 30s 和(he) 150s 的吸(xi)光(guang)值(zhi)A1 和(he)A2，△A=A1-A2。

MDHAR 活(huo)性(xing)計算公式：

按(an)蛋(dan)白(bai)濃(nong)度計(ji)算

MDHAR 活(huo)性(xing)單位定義(yi)：25℃中(zhong)每毫克蛋(dan)白(bai)每分鐘氧(yang)化(hua) 1nmol NADH 為(wei) 1 個(ge)酶(mei)活(huo)單(dan)位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)×109]÷（Cpr×V 樣）÷T

= 804×△A ÷Cpr

按(an)樣本質量(liang)計算(suan)

MDHAR 活(huo)性(xing)單位定義(yi)：25℃中(zhong)每克樣(yang)本每分鐘氧(yang)化(hua) 1nmol NADH 為(wei) 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鮮重(zhong)) = △A÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)×109]÷（W×V 樣÷V 樣總(zong)）÷T= 804×△A ÷W

按(an)細(xi)胞(bao)數量(liang)計算

MDHAR 活(huo)性(xing)單位定義(yi)：25℃中(zhong)每 104 個(ge)細(xi)胞(bao)每(mei)分鐘氧(yang)化(hua) 1nmol NADH 為(wei) 1 個(ge)酶(mei)活(huo)單(dan)位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)×109÷（細(xi)胞(bao)數量(liang)×V 樣÷V 樣總(zong)）÷T

= 804×△A ÷ 細(xi)胞(bao)數量(liang)

按(an)液體(ti)體(ti)積(ji)計(ji)算(suan)

MDHAR 活(huo)性(xing)單位定義(yi)：25℃中(zhong)每毫升液體(ti)每(mei)分鐘氧(yang)化(hua) 1nmol NADH 為(wei) 1 個(ge)酶(mei)活(huo)單(dan)位。

MDHAR (nmol/min /ml) = △A÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)×109÷V 樣）÷T

= 804×△A

ε：NADH 摩爾消光(guang)系(xi)數，6220 L/mol/cm；d：比(bi)色(se)皿光(guang)徑，1cm；V 反(fan)總(zong)：反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)總(zong)體(ti)積(ji)，1ml=0.001 L， V 樣(yang)：加入(ru)反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)中(zhong)上清液體(ti)積(ji)，100μl=0.1ml；Cpr：上(shang)清液蛋(dan)白(bai)濃(nong)度，mg/ml，蛋(dan)白(bai)質濃(nong)度需(xu)要另外測定，建議使用(yong)本公司(si)蛋(dan)白(bai)質含(han)量 BCA 試劑(ji)盒(he)；V 樣(yang)總(zong)：加入(ru)提(ti)取(qu)液體(ti)積(ji)，1ml；W，樣(yang)本質量(liang)，g；T：反(fan)應(ying)時間(jian)，2min。

註(zhu)意事(shi)項：

臨(lin)用(yong)前(qian)配制(zhi)的試劑(ji)未使(shi)用(yong)完(wan)的(de) 4℃保(bao)存(cun)，3 天(tian)內使用(yong)完(wan)。

單(dan)脫氫抗壞(huai)血(xue)酸還原酶試劑(ji)盒(he)