中性條件下，NP 催化(hua)酪(lao)蛋(dan)白(bai)水解產(chan)生(sheng)酪(lao)an酸(suan)；在(zai)堿(jian)性條件下，酪(lao)an酸(suan)還(hai)原磷鉬(mu)酸(suan)化(hua)合(he)物生(sheng)成(cheng)鎢藍(lan)；在(zai) 680nm 有特征(zheng)吸收(shou)峰。
中性蛋(dan)bai酶(mei)活性測定試劑盒(he)

中性蛋(dan)bai酶(mei)（Neutral protease, NP）活(huo)性測定試劑盒(he)說(shuo)明(ming)書

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)法 50 管/24 樣

中性蛋(dan)bai酶(mei)活性測定試劑盒(he)

註(zhu)意(yi)：正(zheng)式(shi)測定前務(wu)必取 2-3 個(ge)預(yu)期(qi)差(cha)異(yi)較(jiao)大的(de)樣本做(zuo)預測定測(ce)定意義：

NP 在(zai)壹(yi)定的(de)溫度和中性pH條件下，催化(hua)水解蛋(dan)白(bai)質(zhi)。由於其(qi)安(an)全(quan)無毒、水解能(neng)力(li)強(qiang)、作用範圍廣(guang)等(deng)特點(dian)，中性蛋(dan)bai酶(mei)常用於(yu)食(shi)品、飼(si)料(liao)、化(hua)妝(zhuang)品和營(ying)養保健(jian)品生(sheng)產(chan)。

測(ce)定原理(li)：

中性條件下，NP 催化(hua)酪(lao)蛋(dan)白(bai)水解產(chan)生(sheng)酪(lao)an酸(suan)；在(zai)堿(jian)性條件下，酪(lao)an酸(suan)還(hai)原磷鉬(mu)酸(suan)化(hua)合(he)物生(sheng)成(cheng)鎢藍(lan)；在(zai) 680nm 有(you)特征(zheng)吸收(shou)峰。

組(zu)成(cheng)：

試(shi)劑二：粉(fen)劑×1 瓶，4℃保(bao)存(cun)。臨用前(qian)加(jia) 10 ml 蒸餾水溶解。

試(shi)劑三：粉(fen)劑×1 瓶，4℃避光(guang)保(bao)存。臨用前(qian)加(jia)入 20 ml 試劑壹，沸(fei)水浴(yu)中磁(ci)力(li)攪(jiao)拌溶解。（可在燒(shao)杯上蓋壹層保鮮膜(mo)，註意(yi)觀(guan)察，避免(mian)水分(fen)全(quan)部蒸(zheng)發，壹般加熱(re) 15-30 分(fen)鐘(zhong)，該(gai)試(shi)劑為過(guo)飽(bao)和試劑，充分(fen)混(hun)勻後(hou)仍出現顆(ke)粒(li)物(wu)不溶物不影響使用）。

試(shi)劑四：粉(fen)劑×1 瓶， 4℃保(bao)存(cun)。臨用前(qian)加(jia) 50 ml 蒸餾水溶解。

標準(zhun)品：液體 1ml×1 支，0.25 μ mol/ml 標準(zhun)酪(lao)an酸(suan)溶液，4℃保存。

自(zi)備(bei)儀器和(he)用品：

可見分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、水浴(yu)鍋(guo)、磁(ci)力(li)攪(jiao)拌器(qi)、可調式(shi)移液槍(qiang)、1ml 玻(bo)璃(li)比色皿、1.5 ml EP 管和蒸餾(liu)水。

粗(cu)酶(mei)液提(ti)取：

1、 組(zu)織(zhi)：按(an)照組(zu)織質(zhi)量（g）：試劑壹體(ti)積(ml)為(wei) 1：5~10 的(de)比例(li)（建(jian)議稱取約(yue) 0.1g 組(zu)織，加入 1ml 試(shi)劑壹）冰浴(yu)勻漿(jiang)，8000g，4℃離(li)心 10min，取上清，即(ji)粗(cu)酶(mei)液。

2、血(xue)清或培養液：直接(jie)測定。

3、細菌、真(zhen)菌：按(an)照細胞數(shu)量（104 個）：試(shi)劑壹體(ti)積（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比例(li)（建(jian)議 500 萬細胞加(jia)入 1ml 試劑壹），冰浴(yu)超聲(sheng)波破(po)碎細胞（功(gong)率 300w，超聲(sheng) 3 秒(miao)，間(jian)隔 7 秒(miao)，總時(shi)間 3min）；然後 8000g， 4℃，離心 10min，取上清置於冰上待測。

測(ce)定操(cao)作：

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計預(yu)熱(re) 30min，調(tiao)節(jie)波(bo)長到 680 nm，蒸餾水調零(ling)。

試(shi)劑二、試劑三和試劑四置於 30℃水浴(yu)保溫(wen) 30min。

對照管：取壹(yi)支 EP 管，加入 100μl 粗(cu)酶(mei)液，200μl 試劑二，混(hun)勻後(hou)置於 30℃水浴(yu)保溫(wen) 10min；加(jia)入(ru) 200μl試劑三，混(hun)勻後(hou) 8000g， 4℃離心 10min；取 200μl 上清液，加入新的(de) EP 管，再加入(ru) 1000μl 試(shi)劑四，200μl試(shi)劑五，混(hun)勻後(hou)置於 30℃水浴(yu)保溫(wen) 20min，於(yu) 680nm 測(ce)定光(guang)吸(xi)收(shou)，記為(wei) A 對照管。

測(ce)定管：取壹(yi)支 EP 管，加入 100μl 粗(cu)酶(mei)液，200μl 試劑三，混(hun)勻後(hou)置於 30℃水浴(yu)保溫(wen) 10min；加(jia)入(ru) 200μl試劑二，混(hun)勻後(hou) 8000g， 4℃離心 10min；取 200μl 上清液，加入新的(de) EP 管，再加入(ru) 1000μl 試(shi)劑四，200μl試(shi)劑五，混(hun)勻後(hou)置於 30℃水浴(yu)保溫(wen) 20min，於(yu) 680nm 測(ce)定光(guang)吸(xi)收(shou)，記為(wei)A 測(ce)定管。（註意與(yu)空(kong)白管不同，先加試劑三，後加試劑二）

空(kong)白(bai)管：取 EP 管，加入 200μl 蒸(zheng)餾(liu)水，1000μl 試劑四，200μl 試(shi)劑五，混(hun)勻後(hou)置於 30℃水浴(yu)保溫(wen) 20min，於(yu) 680nm 測(ce)定光(guang)吸(xi)收(shou)，記為(wei)A 空(kong)白(bai)管。

標準(zhun)管：取 EP 管，加入 200μl 標準(zhun)品，1000μl 試劑四，200μl 試(shi)劑五，混(hun)勻後(hou)置於 30℃水浴(yu)保溫(wen) 20min，於(yu) 680nm 測(ce)定光(guang)吸(xi)收(shou)，記為(wei)A 標準(zhun)管。

註(zhu)意(yi)：空(kong)白管和標準(zhun)管只需(xu)要(yao)測(ce)定壹次。

計算公(gong)式(shi)：

按(an)照樣(yang)本蛋(dan)白(bai)濃度(du)計算

NP 活(huo)性單位定義：30℃每(mei)毫克(ke)蛋(dan)白(bai)每(mei)分(fen)鐘(zhong)水解產(chan)生(sheng) 1nmol 酪(lao)an酸(suan)為(wei) 1 個(ge)酶(mei)活單位。

NP 活(huo)性（nmol/min /mg prot）= C 標準(zhun)品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白管）×V 反總

÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 測(ce)定管－A 對照管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白管）÷Cpr 2．按(an)照樣(yang)本質(zhi)量計算

NP 活(huo)性單位定義：30℃每(mei)克(ke)樣品每(mei)分(fen)鐘(zhong)催化(hua)水解產(chan)生(sheng) 1 nmol 酪(lao)an酸(suan)為(wei) 1 個(ge)酶(mei)活單位。

NP 活(huo)性（nmol/min /g 鮮重(zhong)）=C 標準(zhun)品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白管）×V 反總÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白管）÷W

3. 按(an)照液體體積計算

NP 活(huo)性單位定義：30℃每(mei)毫升樣(yang)品每(mei)分(fen)鐘(zhong)催化(hua)水解產(chan)生(sheng) 1nmol 酪(lao)an酸(suan)為(wei) 1 個(ge)酶(mei)活單位。

NP 活(huo)性（nmol/min/ml）=C 標準(zhun)品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白管）×V 反總÷V1÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白管）

1.  按(an)照細胞數(shu)量計算

NP 活(huo)性單位定義：30℃每(mei) 104 個(ge)細胞每(mei)分(fen)鐘(zhong)催化(hua)水解產(chan)生(sheng) 1nmol 酪(lao)an酸(suan)為(wei) 1 個(ge)酶(mei)活單位。

NP 活(huo)性（nmol/min /104 cell）=C 標準(zhun)品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白管）×V 反總÷（細胞數(shu)量×V1÷V2）÷T= 125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白管）÷細胞數(shu)量

C 標準(zhun)品：0.25 μ mol/ml 標準(zhun)酪(lao)an酸(suan)溶液；V 反總：酶促(cu)反應總體積，0.5ml；Cpr：粗(cu)酶(mei)液蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃度(du)（mg/ml）； V1：加(jia)入反(fan)應體(ti)系(xi)中粗(cu)酶(mei)液體積（ml），0.1 ml；V2：提(ti)取液總體積（ml），1ml；T：催化(hua)反(fan)應時(shi)間（min）， 10min；W：樣品質(zhi)量（g）。

註(zhu)意(yi)事項(xiang)：

臨用前(qian)配制的(de)試劑配制好(hao)後(hou) 4℃保(bao)存(cun)，並(bing)且(qie) 3 天內使(shi)用完(wan)畢(bi)。

中性蛋(dan)bai酶(mei)活性測定試劑盒(he)