AKP 是(shi)指(zhi)在(zai)堿性條件下催(cui)化(hua)蛋白(bai)質(zhi)肽鍵(jian)水解(jie)的(de)酶(mei)類(lei)，屬於絲an酸(suan)蛋白(bai)酶(mei)。此(ci)外，該(gai)酶還能(neng)夠(gou)水(shui)解(jie)酯鍵(jian)、酰胺鍵(jian)，具有轉(zhuan)酯(zhi)及轉(zhuan)肽的(de)功(gong)能(neng)。該(gai)酶是(shi)主(zhu)要(yao)工(gong)業(ye)用(yong)酶之壹(yi)，廣泛(fan)應(ying)用(yong)於制(zhi)藥(yao)、絲綢(chou)、食品、制(zhi)革(ge)等行業(ye)。
堿性(xing)蛋白(bai)酶(mei)活(huo)性(xing)測定(ding)試(shi)劑盒

堿性蛋白(bai)酶(mei)（Alkaline protease, AKP）活性測定(ding)試(shi)劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

堿性蛋白(bai)酶(mei)活(huo)性(xing)測定(ding)試(shi)劑盒

正(zheng)式測定(ding)前務(wu)必(bi)取(qu) 2-3 個預期差(cha)異較(jiao)大(da)的(de)樣(yang)本做預測定(ding)測定(ding)意(yi)義(yi)：

AKP 是(shi)指(zhi)在(zai)堿性條件下催(cui)化(hua)蛋白(bai)質(zhi)肽鍵(jian)水解(jie)的(de)酶(mei)類(lei)，屬於絲an酸(suan)蛋白(bai)酶(mei)。此(ci)外，該(gai)酶還能(neng)夠(gou)水(shui)解(jie)酯鍵(jian)、酰胺鍵(jian)，具有轉(zhuan)酯(zhi)及轉(zhuan)肽的(de)功(gong)能(neng)。該(gai)酶是(shi)主(zhu)要(yao)工(gong)業(ye)用(yong)酶之壹(yi)，廣泛(fan)應(ying)用(yong)於制(zhi)藥(yao)、絲綢(chou)、食品、制(zhi)革(ge)等行業(ye)。

測定(ding)原(yuan)理(li)：

在(zai)堿性條件下，AKP 水解(jie)酪(lao)蛋白(bai)生(sheng)成(cheng)酪(lao)an酸；在(zai)堿性條件下，酪(lao)an酸還原(yuan)磷鉬酸(suan)生成(cheng)鎢藍；鎢(wu)藍在(zai)680nm 有特征(zheng)吸收峰(feng)，測定(ding) 680nm 吸光度增加(jia)速(su)率，來計(ji)算(suan)AKP 活性。

組成：

試(shi)劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存(cun)。臨(lin)用(yong)前加(jia) 10 ml 蒸餾水溶(rong)解(jie)。

試(shi)劑三(san)：粉劑×1 瓶，4℃避光保存(cun)。臨(lin)用(yong)前加(jia)入(ru) 20 ml 試(shi)劑壹，沸水浴中磁(ci)力攪拌(ban)溶解(jie)。（可在(zai)燒(shao)杯(bei)上(shang)蓋壹(yi)層保鮮膜(mo)，註意(yi)觀察，避(bi)免(mian)水分全(quan)部蒸(zheng)發，壹般(ban)加(jia)熱(re) 15-30 分鐘(zhong)，該(gai)試(shi)劑為過飽(bao)和(he)試(shi)劑，充分混勻後仍出現(xian)顆粒(li)物(wu)不(bu)溶(rong)物(wu)不(bu)影(ying)響(xiang)使(shi)用(yong)）。

試(shi)劑四：粉劑×1 瓶， 4℃保存(cun)。臨(lin)用(yong)前加(jia) 50 ml 蒸餾水溶(rong)解(jie)。

標準(zhun)品：液體(ti) 1ml×1 支，0.25 μ mol/ml 標準(zhun)酪(lao)an酸溶(rong)液，4℃保存(cun)。

自備儀(yi)器和(he)用(yong)品：

可見分(fen)光光度計(ji)、水浴(yu)鍋、磁(ci)力攪拌(ban)器、可調式移(yi)液槍(qiang)、1.5 ml EP 管、1ml 玻璃(li)比(bi)色(se)皿和(he)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

粗(cu)酶液提(ti)取(qu)：

組織(zhi)：按(an)照(zhao)組織(zhi)質(zhi)量(liang)（g）：試(shi)劑壹體(ti)積(ji)(mL)為 1：5~10 的(de)比(bi)例(li)（建(jian)議稱(cheng)取(qu)約 0.1g 組織(zhi)，加(jia)入(ru) 1mL 試(shi)劑壹）冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取(qu)上(shang)清，即(ji)粗(cu)酶液。

血清或(huo)培養液：直(zhi)接測定(ding)。

細菌(jun)、真菌(jun)：按(an)照(zhao)細胞(bao)數(shu)量(liang)（10⁴ 個）：試(shi)劑壹體(ti)積(ji)（mL）為 500~1000：1 的(de)比(bi)例(li)（建(jian)議 500 萬細胞(bao)加(jia)入(ru) 1mL 試(shi)劑壹），冰浴超(chao)聲(sheng)波破碎(sui)細(xi)胞(bao)（功率 300w，超(chao)聲(sheng) 3 秒(miao)，間(jian)隔 7 秒(miao)，總時間(jian) 3min）；然後 8000g，4℃，離心 10min，取(qu)上(shang)清置於冰(bing)上(shang)待測。

測定(ding)操(cao)作：

分光光度計(ji)預熱 30min，調節(jie)波長到(dao) 680 nm，蒸餾水調(tiao)零(ling)。

試(shi)劑二、試(shi)劑三(san)和試(shi)劑四置於 40℃水浴保溫(wen) 30min。

對照(zhao)管：取(qu)壹支(zhi)EP 管，加(jia)入(ru) 100μL 粗(cu)酶液（血(xue)清或(huo)培養液），200μL 試(shi)劑二，混勻後置於 40℃水(shui)浴(yu)保溫 10min；加(jia)入(ru) 200μL 試(shi)劑三(san)，混勻後 8000g ，4℃離心 10min；取(qu) 200μL 上(shang)清液，加(jia)入(ru)新(xin)的(de)EP 管，再加(jia)

入 1000μL 試(shi)劑四，200μL 試(shi)劑五(wu)，混勻後置於 40℃水(shui)浴(yu)保溫(wen) 20min，於 680nm 測定(ding)光吸收，記(ji)為(wei)A 對照(zhao)管。

測定(ding)管(guan)：取(qu)壹支(zhi)EP 管，加(jia)入(ru) 100μL 粗(cu)酶液（血(xue)清或(huo)培養液），200μL 試(shi)劑三(san)，混勻後置於 40℃水(shui)浴(yu)保溫 10min；加(jia)入(ru) 200μL 試(shi)劑二，混勻後 8000g ，4℃離心 10min；取(qu) 200μL 上(shang)清液，加(jia)入(ru)新(xin)的(de)EP 管，再加(jia)

入 1000μL 試(shi)劑四，200μL 試(shi)劑五(wu)，混勻後置於 40℃水(shui)浴(yu)保溫(wen) 20min，於 680nm 測定(ding)光吸收，記(ji)為(wei)A 測定(ding)管(guan)。（註意(yi)與對(dui)照(zhao)管不(bu)同(tong)，先(xian)加(jia)試(shi)劑三(san)，後加(jia)試(shi)劑二）

空白(bai)管(guan)：取(qu)壹支(zhi)EP 管，加(jia)入(ru) 200μL 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，1000μL 試(shi)劑四 200μL 試(shi)劑五(wu)，混勻後置於 40℃水浴保溫(wen)

20min，於 680nm 測定(ding)光吸收，記(ji)為(wei) A 空白(bai)管(guan)。

標準(zhun)管：取(qu) EP 管，加(jia)入(ru) 200μL 標準(zhun)品，1000μL 試(shi)劑四，200μL 試(shi)劑五(wu)，混勻後置於 40℃水浴保溫(wen) 20min，於 680nm 測定(ding)光吸收，記(ji)為(wei)A 標準(zhun)管。

註意(yi)：空白(bai)管(guan)和(he)標準(zhun)管只(zhi)需要(yao)測定(ding)壹(yi)次(ci)。計(ji)算(suan)公(gong)式：

按(an)照(zhao)樣本蛋(dan)白(bai)濃(nong)度計(ji)算(suan)

AKP 活性單位定(ding)義(yi)：30℃每毫克(ke)蛋(dan)白(bai)每分鐘(zhong)水(shui)解(jie)產生 1nmol 酪(lao)an酸為(wei) 1 個酶活(huo)單位。

AKP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標準(zhun)品×（A 測定(ding)管(guan)－A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白(bai)管(guan)）×V 反(fan)總

÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 測定(ding)管(guan)－A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白(bai)管(guan)）÷Cpr 2．按(an)照(zhao)樣本質(zhi)量(liang)計(ji)算(suan)

AKP 活性單位定(ding)義(yi)：30℃每克樣(yang)品(pin)每分鐘(zhong)催(cui)化(hua)水解(jie)產生 1 nmol 酪(lao)an酸為(wei) 1 個酶活(huo)單位。

AKP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標準(zhun)品×（A 測定(ding)管(guan)－A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白(bai)管(guan)）×V 反(fan)總÷

（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 測定(ding)管(guan)－A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白(bai)管(guan)）÷W

3. 按(an)照(zhao)液體(ti)體(ti)積(ji)計(ji)算(suan)

AKP 活性單位定(ding)義(yi)：30℃每毫升(sheng)樣品(pin)每分鐘(zhong)催(cui)化(hua)水解(jie)產生 1nmol 酪(lao)an酸為(wei) 1 個酶活(huo)單位。

AKP 活性（nmol/min/ml）=C 標準(zhun)品×（A 測定(ding)管(guan)－A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白(bai)管(guan)）×V 反(fan)總÷V1÷T= 125×（A 測定(ding)管(guan)－A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白(bai)管(guan)）

1.  按(an)照(zhao)細胞(bao)數(shu)量(liang)計(ji)算(suan)

AKP 活性單位定(ding)義(yi)：30℃每 10⁴ 個細胞(bao)每分鐘(zhong)催(cui)化(hua)水解(jie)產生 1nmol 酪(lao)an酸為(wei) 1 個酶活(huo)單位。

AKP 活性（nmol/min /10⁴ cell）=C 標準(zhun)品×（A 測定(ding)管(guan)－A 對(dui)照(zhao)管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白(bai)管(guan)）×V 反(fan)總÷（細胞(bao)數(shu)量(liang)×V1÷V2）÷T= 125×（A 測定(ding)管(guan)－A 對照(zhao)管）÷（A 標準(zhun)管－A 空白(bai)管(guan)）÷細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)

C 標準(zhun)品：0.25 μ mol/ml 標準(zhun)酪(lao)an酸溶(rong)液；V 反(fan)總：酶(mei)促反(fan)應總(zong)體(ti)積(ji)，0.5ml；Cpr：粗(cu)酶液蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃度（mg/ml）； V1：加(jia)入(ru)反(fan)應體(ti)系(xi)中粗(cu)酶液體(ti)積(ji)（ml），0.1 ml；V2：提(ti)取(qu)液總(zong)體(ti)積(ji)（ml），1ml；T：催(cui)化(hua)反(fan)應時間(jian)（min）， 10min；W：樣品(pin)質(zhi)量(liang)（g）。

註意(yi)事項(xiang)：

臨(lin)用(yong)前配制(zhi)的(de)試(shi)劑配置好(hao)後 3 天(tian)內(nei)使(shi)用(yong)完(wan)畢(bi)。

堿性蛋白(bai)酶(mei)活(huo)性(xing)測定(ding)試(shi)劑盒