細胞(bao)色素P450 酶是(shi)壹組(zu)主(zhu)要(yao)存(cun)在(zai)於(yu)肝臟的同工(gong)酶，在外源(yuan)物質(zhi)代(dai)謝(xie)中(zhong)具(ju)有重(zhong)要(yao)作(zuo)用，尤(you)其(qi)是(shi)藥物(wu)和毒物的代(dai)謝(xie)。NCR 作(zuo)為P450 酶(mei)系的重(zhong)要(yao)壹(yi)員，催化氧化型(xing) P450 還(hai)原再(zai)生(sheng)。
NADPH-細胞se素C 還(hai)原酶NCR試劑盒(he)P450

NADPH-細(xi)胞(bao)se素C 還(hai)原酶（NCR）試劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

分(fen)光光度法 50 管/48 樣

NADPH-細(xi)胞(bao)se素C 還(hai)原酶NCR試劑盒(he)P450

正式測定(ding)前(qian)務必取(qu) 2-3 個(ge)預期差異(yi)較大(da)的樣(yang)本做測定(ding)

測定(ding)意(yi)義(yi)：

細(xi)胞(bao)色素P450 酶(mei)是(shi)壹組(zu)主(zhu)要(yao)存(cun)在(zai)於(yu)肝臟的同工(gong)酶，在外源(yuan)物質(zhi)代(dai)謝(xie)中(zhong)具(ju)有重(zhong)要(yao)作(zuo)用，尤(you)其(qi)是(shi)藥物(wu)和毒(du)物(wu)的代(dai)謝(xie)。NCR 作(zuo)為P450 酶(mei)系的重(zhong)要(yao)壹(yi)員，催化氧化型(xing) P450 還(hai)原再(zai)生(sheng)。

測定(ding)原理：

NCR 催(cui)化NADPH 還(hai)原氧化型(xing)細(xi)胞se素 c 生(sheng)成(cheng)還(hai)原型(xing)細(xi)胞se素 c，還(hai)原型(xing)細(xi)胞se素 c 在(zai) 550nm 處(chu)有(you)特征(zheng)吸收峰(feng)；通(tong)過(guo)測定(ding) 550nm 吸(xi)光度的增(zeng)加(jia)速(su)率(lv)，來計算(suan) NCR 活(huo)性(xing)。

組(zu)成(cheng)：

試(shi)劑(ji)壹(yi)：粉劑(ji)×1 瓶，4℃保(bao)存(cun)。臨(lin)用前加(jia) 100ml 蒸(zheng)餾(liu)水充(chong)分(fen)溶(rong)解(jie)。

試(shi)劑(ji)三：粉劑(ji)×1 瓶，-20℃保(bao)存(cun)。臨(lin)用前配(pei)制，加(jia) 2.6 ml 蒸(zheng)餾(liu)水充(chong)分(fen)溶(rong)解(jie)，4℃保(bao)存(cun)。試(shi)劑(ji)四(si)：粉劑(ji)×1 瓶，4℃保(bao)存(cun)。臨(lin)用前配(pei)制，加(jia) 550 μl 蒸(zheng)餾(liu)水充(chong)分(fen)溶(rong)解(jie)，4℃保(bao)存(cun)。

自(zi)備(bei)儀(yi)器和用品：

可(ke)見(jian)分(fen)光光度計、普(pu)通(tong)離(li)心機，超(chao)速(su)離心機、可調(tiao)式移(yi)液槍(qiang)、1ml 玻璃比(bi)色皿(min)和蒸(zheng)餾(liu)水。

粗(cu)酶(mei)液提(ti)取(qu)：

1、除(chu)去細(xi)胞核(he)和線(xian)粒體(ti)等(deng)：稱(cheng)約(yue) 0.5g 組(zu)織，加(jia)入 4℃預冷(leng)的 1 ml 試(shi)劑壹(yi)，冰上充(chong)分研磨(mo)，10 000g 4℃離心 30min，取(qu)上清液，轉(zhuan)移(yi)到超(chao)速(su)離心管中(zhong)。

2、粗(cu)制(zhi)微粒體(ti)：4℃，100 000g，離心 60min，棄(qi)上(shang)清(qing)液。

3、除(chu)血紅(hong)蛋白等(deng)雜(za)質：向(xiang)步(bu)驟(zhou) 2 的沈(chen)澱(dian)中(zhong)加(jia) 1 ml 試(shi)劑壹，蓋(gai)緊後充分(fen)震蕩(dang)溶(rong)解(jie)，100 000g 離心 30min，棄(qi)上(shang)清(qing)液。

4、最(zui)終(zhong)微粒體(ti)：向(xiang)步(bu)驟(zhou) 3 的沈(chen)澱(dian)中(zhong)加(jia)試(shi)劑二(er) 0.5 ml，蓋(gai)緊後充分(fen)震蕩(dang)溶(rong)解(jie)，4℃保(bao)存(cun)待(dai)測。

測定(ding)操作(zuo)：

分(fen)光光度計預(yu)熱(re) 30 min，調(tiao)節波長到 550 nm，蒸餾(liu)水調(tiao)零。

試(shi)劑(ji)二(er)在 37℃水浴(yu)中(zhong)預熱(re) 30min。

空(kong)白管：取(qu) 1ml 玻璃比(bi)色皿(min)，依次(ci)加(jia)入 50μl 蒸餾(liu)水、900μl 試(shi)劑(ji)二(er)、50μl 試劑三和(he) 10μl 試劑四(si)，迅(xun)速(su)混勻(yun)後於(yu) 550nm 處(chu)測定(ding) 2min 內(nei)吸光值變(bian)化，第 10 s 和(he)第(di) 130 s 吸(xi)光值分(fen)別記為 A1 和(he)A2，△A 空(kong)白管=A2-A1。

測定(ding)管：取(qu) 1ml 玻璃比(bi)色皿(min)，依次(ci)加(jia)入 50μl 粗(cu)酶(mei)液、900μl 試(shi)劑(ji)二(er)、50μl 試劑三和(he) 10μl 試劑四(si)，迅(xun)速(su)混勻(yun)後於(yu) 550nm 處(chu)測定(ding) 2min 內(nei)吸光值變(bian)化，第 10 s 和(he)第(di) 130 s 吸(xi)光值分(fen)別記為 A3 和(he)A4，△A 測定(ding)管=A4-A3。

註意(yi)：空(kong)白管只需(xu)要(yao)做(zuo)壹次(ci)。

計算(suan)公式：

(1).按(an)照(zhao)蛋(dan)白濃(nong)度計算(suan)

活(huo)性(xing)單位(wei)定(ding)義(yi)：37℃中(zhong)，每(mei)毫(hao)克蛋白每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1nmol 還(hai)原型(xing)細(xi)胞se素 C 為 1 個(ge)酶活單位(wei)。

NCR 酶(mei)活(huo)性(xing) (nmol/min/mg prot)= (△A 測定(ding)管-△A 空(kong)白管)÷ε÷d×V 反總(zong)÷（Cpr×V 樣）÷T

= 529×(△A 測定(ding)管-△A 空(kong)白管)÷Cpr

(2)按(an)照(zhao)樣(yang)本質量(liang)計算(suan)

活(huo)性(xing)單位(wei)定(ding)義(yi)：37℃中(zhong)，每(mei)克樣品每(mei)分鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1nmol 還(hai)原型(xing)細(xi)胞se素 C 為 1 個(ge)酶活單位(wei)。

NCR 酶(mei)活(huo)性(xing)(nmol/min/g 鮮重)= (△A 測定(ding)管-△A 空(kong)白管)÷ε÷d×V 反總(zong)÷（W×V 樣÷V 樣(yang)總(zong)）÷ T

= 265×(△A 測定(ding)管-△A 空(kong)白管)÷W

ε：還(hai)原型(xing)細(xi)胞se素C 摩爾(er)消(xiao)光系數，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿(min)光徑，1cm；V 反總(zong)：反應(ying)體(ti)系總(zong)體(ti)積，1010μl=0.00101L；Cpr：上清(qing)液蛋(dan)白質(zhi)濃(nong)度，mg/ml，需要(yao)另(ling)外測定(ding)；V 樣(yang)：加(jia)入反應(ying)體(ti)系中(zhong)上清(qing)液體(ti)積，50μl=0.05ml；V 樣總(zong)：加(jia)入提(ti)取(qu)液體(ti)積，0.5ml；W：樣本質量(liang)，g；T：反應(ying)時間，2min。

註意(yi)事(shi)項：

試(shi)劑(ji)三、試(shi)劑四(si)臨(lin)用前配(pei)制，配(pei)好(hao)未(wei)使(shi)用完的 4℃可(ke)保(bao)存(cun)兩天。

NADPH-細(xi)胞(bao)se素C 還(hai)原酶NCR試劑盒(he)P450