細胞(bao)色(se)素(su)P450 酶(mei)是壹組(zu)在外(wai)源(yuan)物(wu)質(zhi)代謝(xie)中，尤其(qi)是藥(yao)物(wu)和毒(du)物，具(ju)有(you)重(zhong)要(yao)作用的(de)酶(mei)系(xi)。AND 作為P450酶(mei)系(xi)的(de)重(zhong)要(yao)壹員(yuan)，相(xiang)當於(yu)CYP3A4 亞(ya)型(xing)，與(yu)藥物(wu)的(de)去(qu)甲基(ji)化反(fan)應(ying)密(mi)切(qie)相(xiang)關。
氨基(ji)bi林-N-脫(tuo)甲(jia)基(ji)酶(mei)AND試(shi)劑(ji)盒(he)P450

氨(an)基(ji)bi林-N-脫(tuo)甲(jia)基(ji)酶(mei)（AND）試(shi)劑(ji)盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

分光光度(du)法(fa) 50 管/24 樣(yang)

氨(an)基(ji)bi林-N-脫(tuo)甲(jia)基(ji)酶(mei)AND試(shi)劑(ji)盒(he)P450

正(zheng)式測(ce)定(ding)前務必取 2-3 個(ge)預期差(cha)異(yi)較(jiao)大(da)的(de)樣(yang)本做預測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意(yi)義：

細(xi)胞(bao)色(se)素(su)P450 酶(mei)是壹組(zu)在外(wai)源(yuan)物(wu)質(zhi)代謝(xie)中，尤其(qi)是藥(yao)物(wu)和毒(du)物，具(ju)有(you)重(zhong)要(yao)作用的(de)酶(mei)系(xi)。AND 作為P450酶(mei)系(xi)的(de)重(zhong)要(yao)壹員(yuan)，相(xiang)當於(yu)CYP3A4 亞(ya)型(xing)，與(yu)藥物(wu)的(de)去(qu)甲基(ji)化反(fan)應(ying)密(mi)切(qie)相(xiang)關。

測(ce)定(ding)原(yuan)理(li)：

AND 催(cui)化(hua)氨基(ji)bi林釋(shi)放(fang)甲醛，通過 Nash 比色(se)法測(ce)定(ding)甲(jia)醛含(han)量，即(ji)可計(ji)算(suan)出 AND 活(huo)性(xing)。

組(zu)成(cheng)：

試(shi)劑(ji)壹：粉劑(ji)×1 瓶，4℃保存(cun)。臨(lin)用前加 50ml 蒸(zheng)餾(liu)水充(chong)分溶(rong)解(jie)。

試(shi)劑(ji)三：粉劑(ji)×1 瓶（棕(zong)色(se)瓶），4℃避(bi)光保(bao)存(cun)。臨(lin)用前加入(ru) 2.6ml 無(wu)水乙醇(chun)，充(chong)分溶(rong)解(jie)。試(shi)劑(ji)四(si)：粉劑(ji)×1 瓶，4℃保存(cun)。臨(lin)用前加入(ru) 2.6ml 蒸(zheng)餾水，充(chong)分溶(rong)解(jie)。

試(shi)劑(ji)五：粉劑(ji)×1 瓶，室溫保(bao)存(cun)。臨(lin)用前加蒸(zheng)餾(liu)水 10ml 充(chong)分溶(rong)解(jie)。

標(biao)準液(ye)：液(ye)體(ti)×1 瓶，-20℃保(bao)存(cun)。臨(lin)用前取 1.5ml EP 管，加入(ru) 10μl 標(biao)準液(ye)，加 990μl 蒸(zheng)餾(liu)水，混(hun)勻(yun)即(ji)為0.05 mmol/L 標準甲quan溶(rong)液(ye)，4℃保存(cun)。

自(zi)備儀器(qi)和(he)用(yong)品：

可見分光光度(du)計(ji)、普通離心(xin)機，超速(su)離心(xin)機、水浴(yu)鍋、可調(tiao)式(shi)移液(ye)槍、1ml 玻(bo)璃(li)比色(se)皿、蒸餾水、無(wu)水乙醇(chun)和冰(bing)。

粗酶(mei)液(ye)提取：

1、除(chu)去(qu)細(xi)胞(bao)核，線(xian)粒(li)體(ti)等(deng)大(da)分子(zi)物質：稱約(yue) 0.5g 組(zu)織(zhi)，加入(ru) 1ml 試(shi)劑(ji)壹，冰(bing)上充(chong)分研(yan)磨(mo)，10000g 4℃

離心(xin) 30min，取上清液(ye)轉入(ru)超速(su)離心(xin)管。

2、粗制(zhi)微粒(li)體(ti)：4℃，10000g，離心(xin) 60min，棄上清液(ye)。

3、除(chu)血(xue)紅蛋白(bai)等(deng)雜質(zhi)：向步(bu)驟 2 的(de)沈(chen)澱(dian)中(zhong)加 1ml 試(shi)劑(ji)壹，蓋(gai)緊(jin)後充(chong)分震蕩(dang)溶(rong)解(jie)，10000g 離心(xin) 30min，棄上清液(ye)。

4、最(zui)終微粒(li)體(ti)：向步(bu)驟 3 的(de)沈(chen)澱(dian)中(zhong)加試(shi)劑(ji)二 0.5ml，蓋緊後充(chong)分震蕩(dang)溶(rong)解(jie)，即(ji)粗酶(mei)液(ye)，待測(ce)。該待測(ce)液(ye)需當天(tian)使(shi)用。

AND 活(huo)性(xing)測(ce)定(ding)操(cao)作：

分光光度(du)計(ji)預熱(re) 30 min，調(tiao)節(jie)波(bo)長(chang)到(dao) 412 nm，蒸(zheng)餾水調(tiao)零。

試(shi)劑(ji)二置(zhi)於(yu) 37℃水浴(yu)中預熱(re) 30min。

對(dui)照(zhao)管：取 1 支EP 管，加入(ru) 50μl 粗酶(mei)液(ye)，850μl 試劑(ji)二，50μl 試劑(ji)三，50μl 蒸餾水，混(hun)勻(yun)後置(zhi)於(yu)37℃水浴(yu)保溫 30min；立(li)即(ji)加入(ru) 175μl 試(shi)劑(ji)五，混(hun)勻(yun)後置(zhi)於(yu)冰(bing)浴(yu)中(zhong) 5min；取出後加入(ru) 175μl 試(shi)劑(ji)六(liu)，混(hun)勻(yun)後室溫靜置(zhi) 5min；室溫 8000rpm 離心(xin) 5min；取新(xin)的(de) EP 管，加入(ru) 500μl 上清液(ye)，500μl 試劑(ji)七(qi)，混(hun)勻(yun)後 60℃水浴(yu) 10min，然後取出，用(yong)冷水冷(leng)卻 5min，於(yu) 412nm 測(ce)定(ding)光吸(xi)收，記為 A 對(dui)照(zhao)管。

測(ce)定(ding)管：取 1 支EP 管，加入(ru) 50μl 粗酶(mei)液(ye)，850μl 試劑(ji)二，50μl 試劑(ji)三，50μl 試劑(ji)四(si)，混(hun)勻(yun)後置(zhi)於(yu)37℃水浴(yu)保溫 30min；立(li)即(ji)加入(ru) 175μl 試(shi)劑(ji)五，混(hun)勻(yun)後置(zhi)於(yu)冰(bing)浴(yu)中(zhong) 5min；取出後加入(ru) 175μl 試(shi)劑(ji)六(liu)，混(hun)勻(yun)後室溫靜置(zhi) 5min；室溫 8000rpm 離心(xin) 5min；取 1 支新(xin)EP 管，加入(ru) 500μl 上清液(ye)，500μl 試劑(ji)七(qi)，混(hun)勻(yun)後 60℃水浴(yu) 10min，然後取出，用(yong)冷水冷(leng)卻 5min，於(yu) 412nm 測(ce)定(ding)光吸(xi)收，記為A 測(ce)定(ding)管。

標(biao)準管：取 1 支EP 管，加入(ru) 500μl 標(biao)準品，500μl 試劑(ji)七(qi)，混(hun)勻(yun)後 60℃水浴(yu) 10min，然後取出，用(yong)冷水冷(leng)卻 5min，於(yu) 412nm 測(ce)定(ding)光吸(xi)收，記為A 標準管。

註意(yi)：每(mei)個(ge)樣(yang)品都需要(yao)做對(dui)照(zhao)管。

AND 活(huo)性(xing)計算(suan)：

按照(zhao)蛋(dan)白濃(nong)度計算:

活(huo)性(xing)單位(wei)定(ding)義(yi)：37℃中(zhong)每(mei)分鐘每(mei)毫(hao)克蛋(dan)白催(cui)化(hua)產生(sheng) 1nmol 甲(jia)醛為 1 個(ge)酶(mei)活(huo)單(dan)位。

AND 活(huo)性(xing)(nmol/min/mg prot)= C 標準品×V 標準品×（A 測(ce)定(ding)管－A 對(dui)照(zhao)管）÷A 標(biao)準管×稀(xi)釋(shi)倍(bei)數÷（Cpr×V樣(yang)）÷T

= 45×（A 測(ce)定(ding)管－A 空(kong)白管）÷A 標(biao)準管÷Cpr

按照(zhao)樣(yang)本質(zhi)量計(ji)算(suan):

活(huo)性(xing)單位(wei)定(ding)義(yi)：37℃中(zhong)每(mei)分鐘每(mei)克(ke)樣(yang)品催(cui)化(hua)產生(sheng) 1nmol 甲(jia)醛為 1 個(ge)酶(mei)活(huo)單(dan)位。

AND 活(huo)性(xing)(nmol/min/g 鮮重(zhong))= C 標準品×V 標準品×（A 測(ce)定(ding)管－A 對(dui)照(zhao)管）÷A 標(biao)準管×稀(xi)釋(shi)倍(bei)數÷(W×V樣(yang))÷T

= 45×（A 測(ce)定(ding)管－A 對(dui)照(zhao)管）÷A 標(biao)準管÷W

C 標(biao)準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標準品：500μl=0.0005 L；稀(xi)釋(shi)倍(bei)數：V 反總(zong)÷V 上清液(ye)=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶(mei)液(ye)蛋白(bai)質濃(nong)度mg/ml，需要(yao)另外測(ce)定(ding)，建(jian)議使(shi)用本公(gong)司BCA 蛋(dan)白(bai)質(zhi)含(han)量測(ce)定(ding)試(shi)劑(ji)盒(he)；V 樣(yang)：加入(ru)粗酶(mei)液(ye)體(ti)積，50μl=0.05ml；W：樣(yang)本質(zhi)量，g ；T：反(fan)應(ying)時(shi)間，30min。

註意(yi)事項(xiang)：

1、粗酶(mei)液(ye)需在當日(ri)完成(cheng)測(ce)定(ding)，如(ru)需保存(cun)，則(ze)向粗酶(mei)液(ye)提取步(bu)驟 3 的(de)沈(chen)澱(dian)中(zhong)加 0.5ml 20%的(de)甘油，分裝後，

-80℃保(bao)存(cun)；

2、試(shi)劑(ji)三和試劑(ji)四(si)需臨用(yong)前配制，如(ru)當天(tian)沒(mei)有(you)用(yong)完，4℃避光保(bao)存(cun)，可用(yong) 1 周(zhou)；

3、粗酶(mei)液(ye)可直(zhi)接(jie)用於(yu)蛋(dan)白(bai)濃(nong)度測(ce)定(ding)，建(jian)議用 BCA 法測(ce)蛋(dan)白(bai)含(han)量。

氨(an)基(ji)bi林-N-脫(tuo)甲(jia)基(ji)酶(mei)AND試(shi)劑(ji)盒(he)P450