細(xi)胞(bao)色(se)素(su)P450 酶(mei)是壹(yi)組主(zhu)要(yao)存(cun)在(zai)於(yu)肝臟(zang)的(de)同(tong)工(gong)酶(mei)，在(zai)外(wai)源(yuan)物質代(dai)謝中(zhong)具有重要(yao)作(zuo)用(yong)，尤(you)其是(shi)藥(yao)物和(he)毒物的(de)代(dai)謝。AH 在(zai)P450 酶(mei)系(xi)中(zhong)相當(dang)於(yu)CYP2E1 亞型(xing)，CYP2E1 不(bu)僅(jin)參與(yu)了藥(yao)物(wu)的(de)代(dai)謝，而且(qie)還(hai)能(neng)催(cui)化多(duo)種(zhong)前致癌物和前毒物(wu)的(de)活(huo)化過(guo)程。
苯(ben)胺-4-羥化酶(mei)AH試劑盒(he)P450

苯胺-4-羥化酶(mei)（AH）試劑盒(he)說明書(shu)

分(fen)光光(guang)度(du)法(fa) 50 管/24 樣

苯胺-4-羥化酶(mei)AH試劑盒(he)P450

正式測定前務必取 2-3 個預期差(cha)異較大的(de)樣本(ben)做預(yu)測定測定意(yi)義：

細胞(bao)色(se)素(su)P450 酶(mei)是壹(yi)組主(zhu)要(yao)存(cun)在(zai)於(yu)肝臟(zang)的(de)同(tong)工(gong)酶(mei)，在(zai)外(wai)源(yuan)物質代(dai)謝中(zhong)具有重要(yao)作(zuo)用(yong)，尤(you)其是(shi)藥(yao)物和(he)毒物的(de)代(dai)謝。AH 在(zai)P450 酶(mei)系(xi)中(zhong)相當(dang)於(yu)CYP2E1 亞型(xing)，CYP2E1 不(bu)僅(jin)參與(yu)了藥(yao)物(wu)的(de)代(dai)謝，而且(qie)還(hai)能(neng)催(cui)化多(duo)種(zhong)前致癌物和前毒物(wu)的(de)活(huo)化過(guo)程。

測定原理：

AH 催(cui)化苯(ben)胺羥化後產生(sheng)的(de) 4-氨基(ji)酚(fen)，進壹(yi)步(bu)轉(zhuan)變為(wei)酚(fen)-吲哚復合(he)物(wu)，在(zai) 630nm 處(chu)有特征吸(xi)收峰(feng)；通過(guo)測定 630nm 吸(xi)光度(du)增加速(su)率，來(lai)計算(suan)AH 活性。

組成：

試劑壹：粉劑×1 瓶(ping)，4℃保(bao)存(cun)。臨(lin)用(yong)前加入 50ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，充(chong)分(fen)溶解(jie)。試劑三：粉劑×1 瓶(ping)，4℃保(bao)存(cun)。臨(lin)用(yong)前加入 26ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，充(chong)分(fen)溶解(jie)。試劑四(si)：粉劑×1 瓶(ping)，4℃保(bao)存(cun)。臨(lin)用(yong)前加入 13ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，充(chong)分(fen)溶解(jie)。

試劑六：粉劑×1 瓶(ping)（腐(fu)蝕(shi)性(xing)試劑），4℃避光(guang)保(bao)存(cun)。臨(lin)用(yong)前加入 26ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，充(chong)分(fen)溶解(jie)。試劑七：粉劑×1 瓶(ping)，4℃保(bao)存(cun)。臨(lin)用(yong)前加入 26ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)充(chong)分(fen)溶解(jie)。

標準液：液體(ti)×1 瓶(ping)，10μmol/L，4℃避光(guang)保(bao)存(cun)。

自備儀(yi)器和(he)用品(pin)：

可見(jian)分(fen)光光(guang)度(du)計(ji)、普通離(li)心機(ji)、超速(su)離(li)心機(ji)、可(ke)調(tiao)式移液槍、1ml 玻(bo)璃(li)比(bi)色(se)皿(min)、雙蒸(zheng)水(shui)和(he)冰(bing)。

粗酶(mei)液提(ti)取：

1、除(chu)去細(xi)胞(bao)核(he)，線粒體(ti)等大分(fen)子物(wu)質：稱約(yue) 0.5g 組織(zhi)，加(jia)入 1ml 試劑壹，冰(bing)上充(chong)分(fen)研磨(mo)，10 000g 4℃，離(li)心 30min，取上清(qing)液，轉(zhuan)移到超速(su)離(li)心管中。

2、粗制微(wei)粒體(ti)： 100 000g 4℃，離(li)心 60min，棄(qi)上清(qing)液。

3、除(chu)血紅蛋白等雜質：向(xiang)步(bu)驟 2 的(de)沈(chen)澱(dian)中(zhong)加(jia) 1ml 試劑壹，蓋(gai)緊(jin)後充(chong)分(fen)震蕩(dang)溶解(jie)，100 000g 離(li)心 30min，棄(qi)上清(qing)液。

4、最(zui)終微(wei)粒體(ti)：向(xiang)步(bu)驟 3 的(de)沈(chen)澱(dian)中(zhong)加(jia)試劑二 0.5ml，蓋(gai)緊(jin)後充(chong)分(fen)震蕩(dang)溶解(jie)，即(ji)粗酶(mei)液，待測。

測定操作(zuo)：

分(fen)光光(guang)度(du)計(ji)預(yu)熱 30 min，調節波(bo)長(chang)到 630 nm，蒸餾(liu)水(shui)調(tiao)零(ling)。

試劑三置於(yu) 37℃水(shui)浴(yu)中(zhong)預熱 30min。

試劑五置於(yu)冰(bing)浴(yu)預(yu)冷 30min。

標準管：取 1.5ml EP 管，加入 500μl 標準液，500μl 試劑六，500μl 試劑七，混(hun)勻後室(shi)溫靜(jing)置 30min，於(yu) 630 nm 測定光吸(xi)收，記為A 標準管。

對照(zhao)管：取 1 支(zhi) 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗(cu)酶(mei)液，500μl 試劑三，250μl 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，混(hun)勻後 37℃水(shui)浴(yu)中(zhong)保(bao)溫 30min；再(zai)加(jia)入 500μl 試劑五，混勻後冰(bing)浴(yu) 5min，11000rpm，4℃，離(li)心 10min；取 500μl 上清(qing)液，加入 1 支(zhi)新的(de) 1.5ml EP 管；再加入 500μl 試劑六，500μl 試劑七，混(hun)勻後室(shi)溫靜(jing)置 30min，於(yu) 630 nm 測定光吸(xi)收，記為A 對(dui)照(zhao)管。

測定管：取 1 支(zhi) 1.5ml EP 管，加入 250μl 粗(cu)酶(mei)液，500μl 試劑三，250μl 試劑四(si)，混勻後 37℃水(shui)浴(yu)中(zhong)保(bao)溫 30min；再(zai)加(jia)入 500μl 試劑五，混勻後冰(bing)浴(yu) 5min，11000rpm，4℃，離(li)心 10min；取 500μl 上清(qing)液，加入 1 支(zhi)新的(de) 1.5ml EP 管；再加入 500μl 試劑六，500μl 試劑七，混(hun)勻後室(shi)溫靜(jing)置 30min，於(yu) 630 nm 測定光吸(xi)收，記為A 測定管。

AH 活性計算(suan)公式：

按照(zhao)蛋白濃度(du)計(ji)算(suan):

活性單位定(ding)義：37℃中每毫(hao)克(ke)蛋白每(mei)分(fen)鐘催(cui)化產生(sheng) 1nmol 4-氨基(ji)酚(fen)為 1 個(ge)酶(mei)活單(dan)位(wei)。

AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照(zhao)管）÷A 標準管×稀釋倍(bei)數(shu)÷（Cpr×V樣）÷T

= 2×（A 測定管－A 對照(zhao)管）÷A 標準管÷Cpr

按照(zhao)樣本(ben)質量計算(suan):

活性單位定(ding)義：37℃中每克樣本(ben)每分(fen)鐘催(cui)化產生(sheng) 1nmol 4-氨基(ji)酚(fen)為 1 個(ge)酶(mei)活單(dan)位(wei)。

AH 活性(nmol/min/g 鮮重)= C 標準品×V 標準品×（A 測定管－A 對照(zhao)管）÷A 標準管×稀釋倍(bei)數(shu)÷(W×V 樣)÷T

= 2×（A 測定管－A 對照(zhao)管）÷A 標準管÷W

C 標準品：10μmol/L；V 標準品：500μl=0.0005L；稀釋倍(bei)數(shu)：V 反(fan)總÷V 上清(qing)液=1500μl÷500μl=3；Cpr：粗酶(mei)液蛋白質(zhi)濃度(du)，mg/ml，需(xu)要(yao)另(ling)外(wai)測定，建議使用(yong)本(ben)公司(si) BCA 蛋白質(zhi)含(han)量測定試劑盒(he)；V 樣：加入反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)中(zhong)粗酶(mei)液體(ti)積(ji)，250μl=0.25ml；W：樣本(ben)質量，g；T：反(fan)應(ying)時(shi)間(jian)，30min。

苯胺-4-羥化酶(mei)AH試劑盒(he)P450