細(xi)胞色(se)素(su)P450 酶是壹組(zu)主要(yao)存在於肝(gan)臟的酶系(xi)，在(zai)外(wai)源物質代謝(xie)中(zhong)，尤其(qi)是藥物(wu)和(he)毒物的(de)代(dai)謝(xie)，具(ju)有重要(yao)作用。ERND 在P450 酶系(xi)中(zhong)相(xiang)當(dang)於CYP2B 亞(ya)型(xing)，與藥(yao)物(wu)代(dai)謝(xie)的(de)去甲基(ji)化(hua)密(mi)切(qie)相(xiang)關。CYP2B 具(ju)有催(cui)化底(di)物(wu)形(xing)成非活性易(yi)於排泄(xie)的(de)代謝(xie)產(chan)物而(er)具(ju)有解(jie)毒作用，也可(ke)使某(mou)些(xie)藥物(wu)經(jing)CYP2B 代謝(xie)活化(hua)。
紅(hong)黴su-N-脫(tuo)甲基(ji)酶試(shi)劑盒(he)P450

紅(hong)黴su-N-脫(tuo)甲基(ji)酶（Erythromycin N-demethylase，ERND）試(shi)劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

分光(guang)光度(du)法(fa) 50 管/24 樣(yang)

紅(hong)黴su-N-脫(tuo)甲基(ji)酶試(shi)劑盒(he)P450

正(zheng)式測定前務必取 2-3 個(ge)預(yu)期(qi)差異(yi)較大的樣(yang)本做(zuo)預(yu)測定測定意義(yi)：

細(xi)胞色(se)素(su)P450 酶是壹組(zu)主要(yao)存在於肝(gan)臟的酶系(xi)，在(zai)外(wai)源物質代謝(xie)中(zhong)，尤其(qi)是藥物(wu)和(he)毒物的(de)代(dai)謝(xie)，具(ju)有重要(yao)作用。ERND 在P450 酶系(xi)中(zhong)相(xiang)當(dang)於CYP2B 亞(ya)型(xing)，與藥(yao)物(wu)代(dai)謝(xie)的(de)去甲基(ji)化(hua)密(mi)切(qie)相(xiang)關。CYP2B 具(ju)有催(cui)化底(di)物(wu)形(xing)成非活性易(yi)於排泄(xie)的(de)代謝(xie)產(chan)物而(er)具(ju)有解(jie)毒作用，也可(ke)使某(mou)些(xie)藥物(wu)經(jing)CYP2B 代謝(xie)活化(hua)。

測定原(yuan)理：

ERND 催(cui)化紅(hong)黴su釋放(fang)甲醛，通(tong)過 Nash 比(bi)色(se)測定甲醛含(han)量，即可(ke)計算(suan)出(chu) ERND 活性。

組成(cheng)：

試(shi)劑壹：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，4℃保存。臨(lin)用前加(jia) 50 ml 蒸餾水溶(rong)解(jie)。

試(shi)劑三(san)：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，4℃保存。臨(lin)用前加(jia) 2.6 ml 蒸餾水，充分(fen)溶解(jie)。試(shi)劑四：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，4℃保存。臨(lin)用前加(jia) 2.6 ml 蒸餾水，充分(fen)溶解(jie)。試(shi)劑五(wu)：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，4℃保存。臨(lin)用前，加(jia)蒸餾水 9 ml 充分(fen)溶解(jie)。

標(biao)準(zhun)液：液體(ti)×1 瓶(ping)，-20℃保存。臨(lin)用前取 1.5 ml EP 管(guan)，加(jia)入 10μl 標(biao)準(zhun)液，加(jia) 990μl 蒸餾水，混(hun)勻(yun)即為0.05 mmol/L 標(biao)準(zhun)甲quan溶液，4℃保存。

自(zi)備(bei)儀(yi)器(qi)和(he)用品：

可(ke)見(jian)分(fen)光光度計(ji)、普(pu)通(tong)離(li)心(xin)機(ji)，超(chao)速離(li)心(xin)機(ji)、可(ke)調式移(yi)液槍、1ml 玻璃比(bi)色(se)皿、蒸餾水和(he)冰。

粗酶液提(ti)取：

1、除去細(xi)胞核(he)，線粒體(ti)等大分子物質：稱(cheng)約(yue) 0.5g 組織(zhi)，加(jia)入 1ml 試(shi)劑壹，冰(bing)上(shang)充分(fen)研(yan)磨，10 000g 4℃離(li)心(xin) 30min，取上(shang)清液，轉入超(chao)速離(li)心(xin)管(guan)中。

2、粗制微粒(li)體(ti)：100 000g，4℃，離(li)心(xin) 60min，棄(qi)上(shang)清液。

3、除血(xue)紅(hong)蛋白等(deng)雜質：向(xiang)步(bu)驟(zhou) 2 的(de)沈澱中(zhong)加(jia) 1ml 試(shi)劑壹，蓋(gai)緊(jin)後(hou)充分(fen)震(zhen)蕩(dang)溶解(jie)，100 000g 離(li)心(xin) 30min，棄(qi)上(shang)清液。

4、最終(zhong)微(wei)粒(li)體(ti)：向(xiang)步(bu)驟(zhou) 3 的(de)沈澱中(zhong)加(jia)試(shi)劑二(er) 0.5ml，充分(fen)震(zhen)蕩(dang)溶解(jie)，即粗酶液，待測。該待(dai)測液需(xu)當(dang)天使(shi)用。

測定操(cao)作：

分光(guang)光度(du)計(ji)預(yu)熱(re) 30 min 以上(shang)，調節(jie)波(bo)長到(dao) 412 nm，蒸餾水調零(ling)。

試(shi)劑二(er)置於 37℃水浴(yu)中(zhong)預(yu)熱(re) 30 min。

對(dui)照管(guan)：取 1 支EP 管(guan)，加(jia)入 50μl 粗酶液，850μl 試(shi)劑二(er)，50μl 試(shi)劑三(san)，50μl 蒸餾水，混(hun)勻(yun)後(hou)置於 37℃水浴(yu)保溫(wen) 30min；立(li)即加(jia)入 175μl 試(shi)劑五(wu)，混(hun)勻(yun)後(hou)置於冰浴(yu)中(zhong) 5min；取出(chu)後(hou)加(jia)入 175μl 試(shi)劑六(liu)，混(hun)勻(yun)後(hou)室(shi)溫(wen)靜(jing)置 5min；室溫 8000rpm 離(li)心(xin) 5min；取新(xin)的(de)EP 管，加(jia)入 500μl 上(shang)清液，500μl 試(shi)劑七，混(hun)勻(yun)後(hou) 60℃水(shui)浴(yu) 10min，然後(hou)取出(chu)，用冷(leng)水(shui)冷(leng)卻(que) 5min，於 412nm 測定光(guang)吸收，記(ji)為A 對(dui)照管(guan)。

測定管(guan)：取 1 支EP 管(guan)，加(jia)入 50μl 粗酶液，850μl 試(shi)劑二(er)，50μl 試(shi)劑三(san)，50μl 試(shi)劑四，混(hun)勻(yun)後(hou)置於 37℃

水浴(yu)保溫(wen) 30min；立(li)即加(jia)入 175μl 試(shi)劑五(wu)，混(hun)勻(yun)後(hou)置於冰浴(yu)中(zhong) 5min；取出(chu)後(hou)加(jia)入 175μl 試(shi)劑六(liu)，混(hun)勻(yun)後(hou)室(shi)

溫靜(jing)置 5min；室溫 8000rpm 離(li)心(xin) 5min；取 1 支新(xin)EP 管(guan)，加(jia)入 500μl 上(shang)清液，500μl 試(shi)劑七，混(hun)勻(yun)後(hou) 60℃

水浴(yu) 10min，然後(hou)取出(chu)，用冷(leng)水(shui)冷(leng)卻(que) 5min，於 412nm 測定光(guang)吸收，記(ji)為A 測定管(guan)。

標(biao)準(zhun)管(guan)：取 1 支EP 管(guan)，加(jia)入 500μl 標(biao)準(zhun)品，500μl 試(shi)劑七，混(hun)勻(yun)後(hou) 60℃水(shui)浴(yu) 10min，然後(hou)取出(chu)，用冷(leng)水(shui)冷(leng)卻(que) 5min，於 412nm 測定光(guang)吸收，記(ji)為A 標(biao)準(zhun)管(guan)。

註意：每(mei)個(ge)樣(yang)品都需(xu)要(yao)做(zuo)對(dui)照管(guan)。

ERND 活性計算(suan)公(gong)式：

(1) 按照蛋白濃(nong)度(du)計(ji)算:

活性單位(wei)定義(yi)：37℃下(xia)，每分(fen)鐘(zhong)每(mei)毫克(ke)蛋白催(cui)化產(chan)生 1nmol 甲醛為(wei) 1 個(ge)酶活單(dan)位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 標(biao)準(zhun)品×V 標(biao)準(zhun)品×（A 測定管(guan)－A 對(dui)照管(guan)）÷A 標(biao)準(zhun)管(guan)×稀(xi)釋(shi)倍數÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A 測定管(guan)－A 對(dui)照管(guan)）÷A 標(biao)準(zhun)管(guan)÷Cpr。

(2). 按照樣(yang)本(ben)質量計(ji)算:

活性單位(wei)定義(yi)：37℃下(xia)，每分(fen)鐘(zhong)每(mei)克(ke)樣(yang)品催(cui)化產(chan)生 1nmol 甲醛為(wei) 1 個(ge)酶活單(dan)位。

ERND 活性(nmol/min/g 鮮重) = C 標(biao)準(zhun)品×V 標(biao)準(zhun)品×（A 測定管(guan)－A 對(dui)照管(guan)）÷A 標(biao)準(zhun)管(guan)×稀(xi)釋(shi)倍數÷（W×V樣）÷T

= 45×（A 測定管(guan)－A 對(dui)照管(guan)）÷A 標(biao)準(zhun)管(guan)÷W

C 標(biao)準(zhun)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 標(biao)準(zhun)品：500μl=0.0005 L；稀釋倍數(shu)：V 反總÷V 上(shang)清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質濃(nong)度(du)，mg/ml，需(xu)要(yao)另(ling)外(wai)測定；V 樣(yang)：加(jia)入粗酶液體(ti)積，50μl=0.05ml；W：樣(yang)本質量，g；T：催(cui)化反(fan)應時(shi)間(jian)，30min。

紅(hong)黴su-N-脫(tuo)甲基(ji)酶試(shi)劑盒(he)P450