胞(bao)色(se)素P450 酶(mei)是壹(yi)組(zu)主(zhu)要(yao)存在(zai)於(yu)肝臟的(de)同(tong)工酶(mei)，在外(wai)源物(wu)質代(dai)謝(xie)中具有(you)重要作(zuo)用(yong)，尤其是藥(yao)物和(he)毒物(wu)的(de)代(dai)謝(xie)。細(xi)胞(bao)色(se)素 P450 和細(xi)胞(bao)色(se)素b5 是P450 酶(mei)系的(de)兩個血(xue)紅(hong)素蛋白(bai)，其比值的(de)變(bian)化(hua)與(yu) P450 代(dai)謝(xie)活(huo)性密切(qie)相關(guan)。
細胞(bao)色(se)素b5含量(liang)測(ce)定試(shi)劑盒(he)

細(xi)胞(bao)色(se)素b5（Cytochrome b5）含(han)量(liang)測(ce)定試(shi)劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

分(fen)光光度法 50 管/48 樣

細(xi)胞(bao)色(se)素b5含量(liang)測(ce)定試(shi)劑盒(he)

正式測(ce)定前(qian)務必取(qu) 2-3 個預(yu)期(qi)差(cha)異較(jiao)大的(de)樣本做(zuo)預測(ce)定測(ce)定意(yi)義：

胞(bao)色(se)素P450 酶(mei)是壹(yi)組(zu)主(zhu)要(yao)存在(zai)於(yu)肝臟的(de)同(tong)工酶(mei)，在外(wai)源物(wu)質代(dai)謝(xie)中具有(you)重要作(zuo)用(yong)，尤其是藥(yao)物和(he)毒物(wu)的(de)代(dai)謝(xie)。細(xi)胞(bao)色(se)素 P450 和(he)細(xi)胞(bao)色(se)素b5 是(shi)P450 酶(mei)系的(de)兩個血(xue)紅(hong)素蛋白(bai)，其比值的(de)變(bian)化(hua)與(yu) P450 代(dai)謝(xie)活(huo)性密切(qie)相關(guan)。

測(ce)定原(yuan)理：

氧(yang)化(hua)型(xing)細胞(bao)色(se)素 b5 經(jing)連(lian)二(er)亞(ya)硫suan鈉(na)還(hai)原(yuan)後(hou)，在(zai) 424nm 處有(you)最(zui)大吸收峰(feng)，通過測(ce)定 424nm 和(he) 490nm 處吸光值的(de)差(cha)異，即可(ke)計(ji)算出細胞(bao)色(se)素b5 的(de)含(han)量(liang)。

組(zu)成(cheng)：

試(shi)劑壹(yi)：粉(fen)劑×1 瓶，4℃保存。臨(lin)用(yong)前(qian)加(jia) 100ml 蒸餾水(shui)，充分溶(rong)解(jie)。

自(zi)備儀器(qi)和用(yong)品：

可(ke)見分光光度計(ji)、普(pu)通離心(xin)機，超速離(li)心(xin)機(ji)、可調式(shi)移液(ye)槍、1ml 玻(bo)璃(li)比色(se)皿和蒸餾水(shui)。

工(gong)作(zuo)液(ye)配制(zhi)：

臨(lin)用(yong)前(qian)配制(zhi)，戴(dai)壹(yi)次(ci)性手(shou)套(tao)，小(xiao)心打開試劑三(san)瓶蓋，加(jia)試劑二(er) 50 ml 充分溶(rong)解(jie)，4℃避(bi)光可保存 1 周(zhou)。

樣品中細胞(bao)色(se)素 b5 提(ti)取(qu)：

1、除(chu)去(qu)細(xi)胞(bao)核，線粒(li)體等(deng)大分子(zi)物(wu)質：稱(cheng)約(yue) 0.5g 組(zu)織(zhi)，加(jia)入 1ml 試(shi)劑壹(yi)，冰(bing)上充分研(yan)磨(mo)，10 000g 4℃離(li)心 30min，取(qu)上清(qing)液(ye)，轉入超速離(li)心(xin)管中。

2、粗(cu)制(zhi)微(wei)粒(li)體：100 000g，4℃離(li)心(xin) 60min，棄(qi)上清(qing)液(ye)。

3、除(chu)血(xue)紅(hong)蛋白(bai)等雜(za)質：向(xiang)步驟(zhou) 2 的(de)沈(chen)澱中加(jia) 1ml 試(shi)劑壹(yi)，蓋緊後(hou)充分震(zhen)蕩溶(rong)解，100 000g 離(li)心(xin) 30min，棄(qi)上清(qing)液(ye)。

4、待(dai)測(ce)液(ye)：向(xiang)步驟(zhou) 3 的(de)沈(chen)澱中加(jia)試劑二(er) 0.5ml，蓋緊後(hou)充分震(zhen)蕩溶(rong)解，即待(dai)測(ce)液(ye)，該待(dai)測(ce)液(ye)需當(dang)天測(ce)定。

細(xi)胞(bao)色(se)素 b5 含(han)量(liang)測(ce)定操(cao)作(zuo)：

分(fen)光光度計(ji)預(yu)熱 30 min。

工(gong)作(zuo)液(ye)置於(yu) 25℃水(shui)浴(yu)中預熱 30 min。

空白(bai)管：取(qu) 1ml 玻(bo)璃(li)比色(se)皿，加(jia)入 50 μl 蒸餾水(shui)，1000μl 工(gong)作(zuo)液(ye)，室(shi)溫靜(jing)置 2 min，424nm 和(he) 490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記(ji)為(wei)A 空白(bai)管 1，490nm 處吸光值記(ji)為(wei)A 空白(bai)管 2。△A 空白(bai)管= A 空白(bai)管 1- A

空白(bai)管 2

測(ce)定管：取(qu) 1ml 玻(bo)璃(li)比色(se)皿，加(jia)入 50 μl 待(dai)測(ce)液(ye)，1000μl 工作(zuo)液(ye)，室(shi)溫靜(jing)置 2 min，424nm 和(he) 490nm 處吸光值，424nm 處吸光值記(ji)為(wei)A 測(ce)定管 1，490nm 處吸光值記(ji)為(wei)A 測(ce)定管 2。△A 測(ce)定管= A 測(ce)定管 1- A

測(ce)定管 2。

註(zhu)意(yi)：只(zhi)需要做(zuo)壹個空白(bai)管。

樣品細胞(bao)色(se)素 b5 含(han)量(liang)計算(suan)公式：

按(an)照(zhao)蛋白(bai)濃度(du)計算:

細(xi)胞(bao)色(se)素b5 含(han)量(liang)(nmol/mg prot)= (△A 測(ce)定管-△A 空白(bai)管)÷ε÷d×V 反(fan)總÷（Cpr×V 樣）

= 123×(△A 測(ce)定管-△A 空白(bai)管)÷Cpr

按(an)照(zhao)樣本質量(liang)計算(suan):

細(xi)胞(bao)色(se)素b5 含(han)量(liang)（nmol/g 鮮重）= (△A 測(ce)定管-△A 空白(bai)管)÷ε÷d×V 反(fan)總×（V 樣總(zong)÷V 樣）÷W

= 61.4×(△A 測(ce)定管-△A 空白(bai)管)÷W

ε：還(hai)原(yuan)型(xing)細胞(bao)色(se)素b5 納摩爾(er)消光系數，171×10^-6 L/nmol/cm；d：比色(se)皿光徑(jing)（cm），1cm； V 反(fan)總：反(fan)應體系(xi)總體積(ji)，1.05 m L=0.00105 L；Cpr：待(dai)測(ce)液(ye)蛋白(bai)質濃(nong)度（mg/ml），需要(yao)另(ling)外(wai)測(ce)定；V 樣：加(jia)入反(fan)應體系(xi)中待(dai)測(ce)液(ye)體積(ji)，50 μl=0.05 ml；V 樣總(zong)：待(dai)測(ce)液(ye)總體(ti)積(ji)，0.5 ml；W：樣品質量(liang)，g。

細(xi)胞(bao)色(se)素b5含量(liang)測(ce)定試(shi)劑盒(he)