選擇(ze)合適的(de)克(ke)隆(long)位點，並(bing)對載體進(jin)行(xing)線(xian)性(xing)化(hua)。盡量選擇(ze)無(wu)重(zhong)復序(xu)列(lie)且載體克(ke)隆(long)位點上(shang)下遊(you)20bp區(qu)域內(nei)GC含量在40%-60%之(zhi)間(jian)的位點進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)。載體線(xian)性(xing)化(hua)方式有(you)限制(zhi)性(xing)內切酶酶(mei)切消化(hua)和反向(xiang)PCR擴增。1）酶(mei)切(qie)制備線(xian)性(xing)化(hua)載體時，推(tui)薦使(shi)用(yong)雙(shuang)酶(mei)切(qie)線(xian)性(xing)化(hua)，線(xian)性(xing)化(hua)wqn全(quan)5.1 制(zhi)備線(xian)性(xing)化(hua)載體
壹(yi)步(bu)克(ke)隆(long)試(shi)劑(ji)盒(he) 克(ke)隆(long)系(xi)列(lie)

壹步(bu)克(ke)隆(long)試(shi)劑(ji)盒(he)

壹步(bu)克(ke)隆(long)試(shi)劑(ji)盒(he) 克(ke)隆(long)系(xi)列(lie)

產品(pin)貨號(hao)：CLO01

產品(pin)名稱(cheng)：壹步(bu)克(ke)隆(long)試(shi)劑(ji)盒(he)

產品(pin)規格(ge)：20T/10μL/T/50T/10μL/T

產品(pin)簡(jian)介(jie)：

NobleRyder® One Step Cloning Kit是(shi)壹(yi)款(kuan)簡(jian)單(dan)、快速(su)、高效的DNA定向(xiang)克(ke)隆(long)技術，可以(yi)將插(cha)入(ru)片段(duan)定向(xiang)克(ke)隆(long)至(zhi)任意(yi)載體的(de)任意(yi)位點。可(ke)以(yi)高效兼容1-5個片段(duan)同(tong)源(yuan)重(zhong)組(zu)，50℃反應(ying)10 - 30 min即(ji)可(ke)進(jin)行(xing)連接(jie)，適用(yong)於(yu)快(kuai)速(su)克(ke)隆(long)，DNA定點突(tu)變(bian)等。

實驗(yan)流程

1.制備(bei)線(xian)性(xing)化(hua)載體

選擇(ze)合適的(de)克(ke)隆(long)位點，並(bing)對載體進(jin)行(xing)線(xian)性(xing)化(hua)。盡量選擇(ze)無(wu)重(zhong)復序(xu)列(lie)且載體克(ke)隆(long)位點上(shang)下遊(you)20bp區(qu)域內(nei)GC含量在40%-60%之(zhi)間(jian)的位點進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)。載體線(xian)性(xing)化(hua)方式有(you)限制(zhi)性(xing)內切酶酶(mei)切消化(hua)和反向(xiang)PCR擴增。1）酶(mei)切(qie)制備線(xian)性(xing)化(hua)載體時，推(tui)薦使(shi)用(yong)雙(shuang)酶(mei)切(qie)線(xian)性(xing)化(hua)，線(xian)性(xing)化(hua)wan全(quan)5.1 制(zhi)備線(xian)性(xing)化(hua)載體

選擇(ze)合適的(de)克(ke)隆(long)位點，對(dui)載體進(jin)行(xing)線(xian)性(xing)化(hua)。選擇(ze)載體克(ke)隆(long)位點附(fu)近無(wu)重(zhong)復序(xu)列(lie)且上(shang)下遊(you)20bp區(qu)域內(nei)GC含量在40%-60%之(zhi)間(jian)的位點進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)。

1）酶切(qie)制(zhi)備(bei)線(xian)性(xing)化(hua)載體，推(tui)薦使(shi)用(yong)雙(shuang)酶(mei)切(qie)方案(an)；單(dan)酶(mei)切(qie)線(xian)性(xing)化(hua)並(bing)不影(ying)響(xiang)無(wu)縫(feng)鏈接(jie)，但(dan)可能(neng)會(hui)有更多(duo)的(de)環狀(zhuang)質粒殘留(liu)，增加(jia)後(hou)期(qi)克(ke)隆(long)的(de)篩選難度。

2）反向(xiang)PCR擴增制(zhi)備(bei)線(xian)性(xing)化(hua)載體，必須使(shi)用(yong)高保真DNA聚(ju)合酶進(jin)行(xing)載體擴增，以(yi)減少(shao)擴增突(tu)變(bian)的(de)引(yin)入(ru)。PCR產物需(xu)要進(jin)行(xing)膠回收(shou)，減少(shao)環狀質(zhi)粒環狀(zhuang)DNA模(mo)板的殘(can)留(liu)。

2.制備(bei)插(cha)入(ru)片段(duan)

通(tong)過(guo)在插(cha)入(ru)片段(duan)正、反向(xiang)引(yin)物5，端(duan)引(yin)入(ru)15-25bp線(xian)性(xing)化(hua)載體末端(duan)同(tong)源(yuan)序列(lie)，使(shi)得插(cha)入(ru)片段(duan)PCR產物5，端(duan)和3，端(duan)的(de)末端(duan)分(fen)別帶有(you)與線(xian)性(xing)化(hua)載體的(de)兩個末端(duan)對(dui)應(ying)的(de)wan全(quan)壹(yi)致的(de)序(xu)列(lie)。使(shi)用(yong)高保真PCR Mix完成(cheng)擴增，獲(huo)得PCR產物後(hou)進(jin)行(xing)瓊脂(zhi)糖(tang)凝(ning)膠電(dian)泳分(fen)析，並(bing)回收(shou)正確(que)的產物片(pian)段(duan)。

插(cha)入(ru)片段(duan)正向(xiang)擴增引(yin)物設(she)計(ji)方式：

5’-上(shang)遊(you)載體末端(duan)同(tong)源(yuan)序列(lie)+酶切(qie)位點（保(bao)留(liu)或刪(shan)除）+基(ji)因特異(yi)性(xing)正向擴增引(yin)物序(xu)列(lie)-3’

插(cha)入(ru)片段(duan)反向(xiang)擴增引(yin)物設(she)計(ji)方式：

3’-基(ji)因特異(yi)性(xing)反向(xiang)擴增引(yin)物序(xu)列(lie)+酶切(qie)位點（保(bao)留(liu)或刪(shan)除）+下遊(you)載體末端(duan)同(tong)源(yuan)序列(lie)-5’

3.線(xian)性(xing)化(hua)載體與插(cha)入(ru)片段(duan)濃度測(ce)定

使(shi)用(yong)NanoDrop或Qubit檢(jian)測線(xian)性(xing)化(hua)載體和插(cha)入(ru)片段(duan)的濃度。

4.重(zhong)組(zu)反應(ying)體(ti)系(xi)的(de)配(pei)制(zhi)

1）線(xian)性(xing)化(hua)載體和插(cha)入(ru)片段(duan)使(shi)用(yong)量計(ji)算

載體與插(cha)入(ru)片段(duan)摩(mo)爾比(bi)為1:2 ~ 1:3；當插(cha)入(ru)片段(duan)長度(du)大於(yu)克(ke)隆(long)載體時，將插(cha)入(ru)片段(duan)當作克(ke)隆(long)載體，克(ke)隆(long)載體當作插(cha)入(ru)片段(duan)計(ji)算。

2）在冰(bing)上(shang)配(pei)制(zhi)反應(ying)體(ti)系(xi)：

3）使(shi)用(yong)移(yi)液器(qi)輕(qing)輕(qing)吸打(da)混勻(yun)並(bing)瞬時離(li)心。

4）50℃反應(ying)20min， 4℃維(wei)持(chi)或取出(chu)後(hou)置(zhi)於(yu)冰(bing)上(shang)冷卻。

5）重(zhong)組(zu)反應(ying)轉(zhuan)化(hua)、塗板(ban)，具(ju)體(ti)方法參照(zhao)感受(shou)態(tai)細(xi)胞(bao)的說明書(shu)。

壹步(bu)克(ke)隆(long)試(shi)劑(ji)盒(he) 克(ke)隆(long)系(xi)列(lie)