輔酶ⅠNAD(H)廣泛(fan)存在(zai)於動(dong)物(wu)、植(zhi)物(wu)、微生物(wu)和(he)培養細胞(bao)中，NAD+是(shi)糖酵(jiao)解（EMP）和(he)三羧(suo)酸(suan)循環(huan)（TCA）的(de)主要氫(qing)受(shou)體(ti)，生成的 NADH 經呼吸(xi)電(dian)子鏈（ETC）傳遞(di)把電(dian)子交給氧，在合成 ATP 的(de)同(tong)時(shi)，形(xing)成大(da)量(liang)的 ROS，同(tong)時(shi) NADH 再(zai)生為 NAD+。
輔酶ⅠNAD(H)含量(liang)試劑(ji)盒(he)-常備現(xian)貨

輔(fu)酶ⅠNAD(H)含量(liang)試劑(ji)盒(he)說(shuo)明書

分(fen)光光(guang)度(du)法(fa) 50 管/24 樣

輔酶ⅠNAD(H)含量(liang)試劑(ji)盒(he)-常備現(xian)貨

正(zheng)式測定(ding)前務必(bi)取(qu) 2-3 個(ge)預期差(cha)異較大(da)的樣本做(zuo)預測定(ding)測定(ding)意義(yi)：

輔酶(mei)ⅠNAD(H)廣(guang)泛(fan)存在(zai)於動(dong)物(wu)、植(zhi)物(wu)、微生物(wu)和(he)培養細胞(bao)中，NAD+是(shi)糖酵(jiao)解（EMP）和(he)三羧(suo)酸(suan)循環(huan)（TCA）的(de)主要氫(qing)受(shou)體(ti)，生成的 NADH 經呼吸(xi)電(dian)子鏈（ETC）傳遞(di)把電(dian)子交給氧，在合成 ATP 的(de)同(tong)時(shi)，形(xing)成大(da)量(liang)的 ROS，同(tong)時(shi) NADH 再(zai)生為 NAD+。糖、脂(zhi)、蛋白(bai)質(zhi)三大(da)代謝(xie)物(wu)質(zhi)分(fen)解中的氧化反應絕大(da)部分(fen)通過這(zhe)壹體系完(wan)成。NAD(H)含量(liang)和(he) NADH/NAD+比值(zhi)的(de)高(gao)低可用(yong)於評價(jia)糖酵(jiao)解和(he) TCA 循環(huan)的(de)強弱。較高的(de) NAD(H)及(ji)NADH/NAD+比值說(shuo)明細胞呼吸(xi)耗氧(yang)量(liang)較高，處(chu)於過氧(yang)化(hua)狀態(tai)。此(ci)外，NADH/NAD+ 比(bi)值升(sheng)高(gao)也(ye)可抑制(zhi)糖(tang)酵(jiao)解和(he) TCA 循環(huan)。另(ling)外，NAD+降解產物(wu)對(dui)細(xi)胞(bao)信(xin)號傳導(dao)、代謝(xie)和(he)基(ji)因(yin)表(biao)達(da)等具有(you) 重要的調(tiao)控作(zuo)用(yong)。

測定(ding)原理：

分(fen)別用(yong)酸(suan)性和(he)堿性提(ti)取(qu)液(ye)提(ti)取(qu)樣(yang)品(pin)中 NAD+和(he) NADH，NADH 通過 PMS 的(de)遞(di)氫(qing)作(zuo)用(yong)，還原氧(yang)化(hua)型噻唑(zuo)藍(lan)（MTT）為(wei)甲(jia)瓚(zan)，在(zai) 570nm 下檢測吸光(guang)值(zhi)；而 NAD+可被(bei)乙(yi)醇脫(tuo)氫(qing)酶(mei)還(hai)原(yuan)為(wei)NADH，進壹步(bu)采(cai)用(yong) MTT 還原法(fa)檢(jian)測(ce)。

組(zu)成(cheng)：

試劑(ji)三(san)：粉(fen)劑×1 瓶，-20 ℃保(bao)存，用(yong)時加入(ru) 4ml 蒸餾(liu)水(shui)，混(hun)勻(yun)，用(yong)不(bu)完(wan)的試(shi)劑 4℃保(bao)存壹周；試(shi)劑(ji)四(si)：粉劑×1 瓶，4 ℃保(bao)存，用(yong)時加入(ru) 4ml 蒸餾(liu)水(shui)，混(hun)勻(yun)，用(yong)不(bu)完(wan)的試(shi)劑 4℃保(bao)存壹周；

自(zi)備(bei)儀器和(he)用(yong)品：

可見(jian)分(fen)光光(guang)度(du)計、臺(tai)式離心機(ji)、移液(ye)器、1 ml 玻(bo)璃比(bi)色皿(min)、研(yan)缽(bo)、冰(bing)和(he)蒸餾(liu)水(shui)。

NAD+和(he) NADH 的提(ti)取(qu) ：

1、 血清（漿(jiang)）中 NAD+和(he) NADH 的提(ti)取(qu)

NAD+的(de)提(ti)取(qu)：按(an)照(zhao)血清（漿(jiang)）體積(ji)（ml）：酸(suan)性提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)（ml）為(wei) 1：5~10 的(de)比(bi)例（建(jian)議(yi)取(qu)約(yue) 0.1ml 血清（漿(jiang)），加入 1ml 酸(suan)性提(ti)取(qu)液(ye)），95℃水(shui)浴 5min（蓋(gai)緊，以(yi)防止水分(fen)散(san)失）；冰(bing)浴(yu)中冷(leng)卻後(hou)，10000g 4 ℃離心 10min；取(qu) 500μl 上清液(ye)，加入(ru) 500μl 堿性提(ti)取(qu)液(ye)使之(zhi)中和(he)，混勻(yun)，10000g 4 ℃離(li)心 10min，取(qu)上清，置(zhi)冰(bing)上待(dai)測。

NADH 的提(ti)取(qu)：按(an)照(zhao)血清（漿(jiang)）體積(ji)（ml）：堿性提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)（ml）為(wei) 1：5~10 的(de)比(bi)例（建(jian)議(yi)取(qu)約(yue) 0.1ml 血清（漿(jiang)），加入 1ml 堿性提(ti)取(qu)液(ye)），95℃水(shui)浴 5min（蓋(gai)緊，以(yi)防止水分(fen)散(san)失）；冰(bing)浴(yu)中冷(leng)卻後(hou)，10000g 4 ℃離心 10min；取(qu) 500μl 上清液(ye)，加入(ru) 500μl 酸(suan)性提(ti)取(qu)液(ye)使之(zhi)中和(he)，混勻(yun)，10000g 4 ℃離(li)心 10min，取(qu)上清，置(zhi)冰(bing)上待(dai)測。

2、 組織(zhi)中 NAD+和(he) NADH 的提(ti)取(qu)：

NAD+的(de)提(ti)取(qu)：按(an)照(zhao)組織(zhi)質(zhi)量(liang)（g）：酸(suan)性提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)（ml）為(wei) 1：5~10 的(de)比(bi)例（建(jian)議(yi)取(qu)約(yue) 0.1g組(zu)織(zhi)，加入(ru) 1ml 酸(suan)性提(ti)取(qu)液(ye)），冰(bing)浴(yu)研(yan)磨(mo)，95℃水浴 5min（蓋(gai)緊，以(yi)防止水分(fen)散(san)失）；冰(bing)浴(yu)中冷(leng)卻後(hou)，10000g 4 ℃離心 10min；取(qu) 500μl 上清液(ye)，加入(ru) 500μl 堿性提(ti)取(qu)液(ye)使之(zhi)中和(he)，混勻(yun)，10000g 4 ℃離(li)心 10min，取(qu)上清，置(zhi)冰(bing)上待(dai)測。

NADH 的提(ti)取(qu)：按(an)照(zhao)組織(zhi)質(zhi)量(liang)（g）：堿性提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)（ml）為(wei) 1：5~10 的(de)比(bi)例（建(jian)議(yi)取(qu)約(yue) 0.1g組(zu)織(zhi)，加入(ru) 1ml 堿性提(ti)取(qu)液(ye)），冰(bing)浴(yu)研(yan)磨(mo)，95℃水浴 5min（蓋(gai)緊，以(yi)防止水分(fen)散(san)失）；冰(bing)浴(yu)中冷(leng)卻後(hou)，10000g 4 ℃離心 10min；取(qu) 500μl 上清液(ye)，加入(ru) 500μl 酸(suan)性提(ti)取(qu)液(ye)使之(zhi)中和(he)， 混勻(yun)，10000g 4 ℃離(li)心 10min，取(qu)上清，置(zhi)冰(bing)上待(dai)測。

3、 細胞或(huo)細(xi)菌(jun)中 NAD+和(he) NADH 的提(ti)取(qu)：

NAD+的(de)提(ti)取(qu)：先收集細胞(bao)或(huo)細(xi)菌(jun)到(dao)離(li)心管內，棄(qi)上清，按(an)照(zhao)細菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)（104 個(ge)）：酸(suan)性

提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比(bi)例（建(jian)議(yi) 500 萬(wan)細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)加(jia)入(ru) 1ml 酸(suan)性提(ti)取(qu)液(ye)），超(chao)聲波(bo)破(po)碎（冰(bing)浴(yu)，功(gong)率(lv) 20％或(huo) 200W，超(chao)聲 3s，間(jian)隔 10s，重復 30 次(ci)），95℃水(shui)浴(yu) 5min（蓋(gai)緊，以(yi)防止水分(fen)散(san)失）；冰(bing)浴(yu)中冷(leng)卻後(hou)，10000g 4 ℃離心 10min；取(qu) 500μl 上清液(ye)，加入(ru) 500μl 堿性提(ti)取(qu)液(ye)使之(zhi)中和(he)，混勻(yun)，10000g 4 ℃離(li)心 10min，取(qu)上清，置(zhi)冰(bing)上待(dai)測。

NADH 的提(ti)取(qu)：先收集細胞(bao)或(huo)細(xi)菌(jun)到(dao)離(li)心管內，棄(qi)上清，按(an)照(zhao)細菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)（104 個(ge)）：堿性提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比(bi)例（建(jian)議(yi) 500 萬(wan)細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)加(jia)入(ru) 1ml 堿性提(ti)取(qu)液(ye)），超(chao)聲波(bo)破(po)碎（冰(bing)浴(yu)，功(gong)率(lv) 20％或(huo) 200W，超(chao)聲 3s，間(jian)隔 10s，重復 30 次(ci)），95℃水(shui)浴(yu) 5min（蓋(gai)緊，以(yi)防止水分(fen)散(san)失）；冰(bing)浴(yu)中冷(leng)卻後(hou)，10000g 4 ℃離心 10min；取(qu) 500μl 上清液(ye)，加入(ru) 500μl 酸(suan)性提(ti)取(qu)液(ye)使之(zhi)中和(he)，混勻(yun)，10000g 4 ℃離(li)心 10min，取(qu)上清，置(zhi)冰(bing)上待(dai)測。

測定(ding)步(bu)驟(zhou)：

1、分(fen)光光(guang)度(du)計預熱 30min 以(yi)上，調(tiao)節波(bo)長至(zhi) 570nm，蒸餾(liu)水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、加樣(yang)表(biao)(在(zai) 1.5ml 棕色EP 管中按下表(biao)依(yi)次(ci)加(jia)樣(yang)）：

充分(fen)混勻(yun)，靜(jing)置 5min 後(hou)，20000g，25℃離心 5min，棄(qi)上清，沈(chen)澱中加入：

混(hun)勻，570nm 下比色，讀(du)取(qu)對(dui)照(zhao)吸光(guang)值A1 和(he)測定(ding)管吸光值 A2，計算△A=A2-A1。

註意事項

1、如果(guo)壹次(ci)性測定(ding)樣本數較多，可將試劑(ji)壹、二、三(san)和(he)四(si)按比例配(pei)成混合液。

2、對(dui)照(zhao)管和(he)測定(ding)管的測定(ding)步(bu)驟(zhou)的(de)區(qu)別(bie)：對(dui)照(zhao)管加完(wan)試劑(ji)壹、二、三(san)、四(si)和(he)五後(hou)必(bi)須(xu)馬上加(jia)試劑(ji)六；測定(ding)管加完(wan)試劑(ji)壹、二、三(san)、四(si)和(he)五後(hou)必(bi)須(xu)反應 20min 後(hou)再加試(shi)劑六。

3、反應過程(cheng)中註意避光(guang)。

4、若(ruo) NAD+測(ce)定(ding)中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 測定(ding)中△A（A2-A1）≤0.0222，已(yi)低於檢測(ce)限(xian)，可做(zuo)如下調(tiao)整(zheng)：（1）將測定(ding)管避光靜(jing)置時間(jian) 20min 延長到(dao) 60min；（2）在(zai)提(ti)取(qu)階(jie)段(duan)增加取(qu)樣(yang)量(liang)，即取(qu) 0.2g 樣(yang)本或(huo) 0.2ml 樣(yang)本加入(ru) 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)。

5、由(you)於每壹個(ge)測定(ding)管需要設壹個(ge)對(dui)照(zhao)管，本試劑(ji)盒(he) 50 管保(bao)證(zheng)測(ce) 24 個(ge) NAD+或(huo) NADH.。

NAD+和(he) NADH 含量(liang)的計算：

（壹） NAD+含量(liang)的計算

標準條件(jian)下的回歸(gui)曲線為(wei) y = 0.295x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中 y 為△A，x 為 NAD+濃度(du) nmol/ml

1、血清（漿(jiang)）中 NAD+含量(liang)計算

NAD+含量(liang)(nmol/ml）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=67.8×(△A -0.0302）

2、組織(zhi)、細菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)中 NAD+含量(liang)計算 (1)按(an)樣本蛋白(bai)濃(nong)度(du)計算

NAD+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(V1×Cpr)= 3.4×(△A -0.0302）÷Cpr

按(an)樣本鮮重計算

NAD+ (nmol/g 鮮(xian)重）= [(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(W×V1÷V2)= 6.8×(△A -0.0302）÷W

按細菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)計算

NAD+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.295×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.014×(△A -0.0302）

（二(er)）NADH 含量(liang)的計算

標準條件(jian)下的回歸(gui)曲線為(wei) y = 0.2808x + 0.0222，R2 = 0.9976；其中 y 為△A，x 為 NADH 濃度(du) nmol/ml

1、血清（漿(jiang)）中 NADH 含量(liang)計算

NADH 含量(liang)(nmol/ml）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 71.2×(△A -0.0222）

2、組織(zhi)、細菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)中 NADH 含量(liang)計算

按(an)樣本蛋白(bai)濃(nong)度(du)計算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(V1×Cpr)= 3.6×(△A -0.0222）÷Cpr

按(an)樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮(xian)重）=[(△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 7.1×(△A -0.0222）÷W

按細菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)計算

NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.0222）÷0.2808×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.014×(△A -0.0222）

V1：加(jia)入反應體系中樣本體積(ji)，0.05ml；V2：加(jia)入(ru)提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)，2ml；V3：加(jia)入(ru)血清（漿(jiang)）體積(ji)：0.1ml；Cpr：樣(yang)本蛋白(bai)質(zhi)濃度(du)，mg/ml； W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g；500：細胞(bao)或(huo)細(xi)菌(jun)總(zong)數(shu)， 500 萬(wan)。

註意：最di檢(jian)測限(xian)為 0.1nmol/ml 或(huo) 0.1nmol/g 鮮(xian)重 或(huo) 0.001nmol/mg prot

輔(fu)酶(mei)ⅠNAD(H)含量(liang)試劑(ji)盒(he)-常備現(xian)貨