MDH （EC 1.1.1.37）廣泛(fan)存在(zai)於(yu)動物(wu)、植物、微生物和培(pei)養(yang)細(xi)胞中，線粒體(ti)中MDH 是(shi)TCA 循(xun)環(huan)的關鍵(jian)酶之壹(yi)，催(cui)化(hua)蘋(ping)果酸(suan)形(xing)成草xian乙(yi)酸(suan)；相(xiang)反，胞(bao)漿中 MDH 催(cui)化(hua)草xian乙(yi)酸(suan)形(xing)成蘋果酸(suan)。草xian乙(yi)酸(suan)是(shi)重(zhong)要(yao)的中(zhong)間(jian)產物(wu)， 連接多條重要(yao)的代(dai)謝(xie)途(tu)徑(jing)。
NAD-蘋果酸(suan)脫氫(qing)酶試(shi)劑盒 輔酶Ⅰ

NAD-蘋果酸(suan)脫氫(qing)酶（NAD-MDH）試(shi)劑盒說明書(shu)

分光(guang)光(guang)度(du)法 50 管/48 樣(yang)

NAD-蘋果酸(suan)脫氫(qing)酶試(shi)劑盒 輔酶Ⅰ

正式測(ce)定前(qian)務必(bi)取 2-3 個預(yu)期差異(yi)較大(da)的樣(yang)本做(zuo)預(yu)測(ce)定測(ce)定意(yi)義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛(fan)存(cun)在(zai)於(yu)動物(wu)、植物、微生物和培(pei)養(yang)細(xi)胞中，線粒(li)體(ti)中MDH 是(shi)TCA 循(xun)環(huan)的關鍵(jian)酶之壹(yi)，催(cui)化(hua)蘋(ping)果酸(suan)形(xing)成草xian乙(yi)酸(suan)；相(xiang)反，胞(bao)漿中 MDH 催(cui)化(hua)草xian乙(yi)酸(suan)形(xing)成蘋果酸(suan)。草xian乙(yi)酸(suan)是(shi)重(zhong)要(yao)的中(zhong)間(jian)產物(wu)， 連接多條重要(yao)的代(dai)謝(xie)途(tu)徑(jing)。因此，MDH 在(zai)細(xi)胞(bao)多(duo)種(zhong)生理(li)活動中(zhong)扮(ban)演著(zhe)重(zhong)要(yao)的角(jiao)色，包括線粒體(ti)的能量代謝、 蘋(ping)果酸(suan)-天(tian)冬(dong)an酸(suan)穿梭(suo)系統、活性氧(yang)代謝(xie)和抗(kang)病性等(deng)。根(gen)據(ju)不同的輔(fu)酶特異(yi)性，MDH分(fen)為NAD-依(yi)賴(lai)的MDH 和NADP-依(yi)賴(lai)的MDH，細(xi)菌(jun)中通(tong)常(chang)只(zhi)含(han)有 NAD-MDH，在(zai)真核(he)細(xi)胞中(zhong)，NAD-MDH分布(bu)於(yu)細(xi)胞(bao)質和線(xian)粒體(ti)中。

測(ce)定原(yuan)理(li)：

NAD-MDH 催(cui)化(hua)NADH 還原(yuan)草酰(xian)乙(yi)酸(suan)生成蘋果酸(suan)，導致(zhi) 340nm 處光(guang)吸收下(xia)降(jiang)。

組(zu)成：

試劑(ji)三(san)、粉(fen)劑×2 支，-20℃保(bao)存(cun)；臨用(yong)前(qian)加入(ru) 300μl 蒸餾(liu)水(shui)，充(chong)分(fen)溶解(jie)待(dai)用(yong)；用(yong)不完(wan)的試(shi)劑(ji)分裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復(fu)凍(dong)融。

試劑(ji)四、粉(fen)劑×2 支，-20℃保(bao)存(cun)；臨用(yong)前(qian)加入(ru) 300μl 蒸餾(liu)水(shui)，充(chong)分(fen)溶解(jie)待(dai)用(yong)；用(yong)不完(wan)的試(shi)劑(ji)分裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復(fu)凍(dong)融。

自(zi)備(bei)儀(yi)器(qi)和用(yong)品：

紫(zi)外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、臺式離(li)心機(ji)、水浴鍋(guo)、可調式移液(ye)器、1 ml 石英比色皿(min)和蒸(zheng)餾水。

樣(yang)本測(ce)定的準(zhun)備(bei)：

1、細菌(jun)、細胞(bao)或組(zu)織(zhi)樣(yang)品(pin)的制(zhi)備(bei)：

細菌(jun)或培(pei)養(yang)細(xi)胞：先收集(ji)細菌(jun)或細(xi)胞到離(li)心管(guan)內，離(li)心後(hou)棄上清；按照細(xi)菌(jun)或細(xi)胞數量（104 個）：試(shi)劑(ji)壹(yi)體(ti)積(ji)（ml）為 1000~5000：1 的比(bi)例(li)（建(jian)議 2000 萬(wan)細菌(jun)或細(xi)胞加入(ru) 1ml 試劑(ji)壹(yi)），超(chao)聲波(bo)破(po)碎(sui)細菌(jun)或細(xi)胞（冰浴，功(gong)率 20％或 200W，超(chao)聲 3s，間(jian)隔 10s，重復(fu) 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心 10min，取上清，置冰上待(dai)測(ce)。

組(zu)織(zhi)：按照組(zu)織(zhi)質量（g）：試劑(ji)壹(yi)體(ti)積(ji)(ml)為 1：5~10 的比(bi)例(li)（建(jian)議稱(cheng)取約 0.1g 組(zu)織(zhi)，加入 1ml 試(shi)劑(ji)壹(yi)），進行(xing)冰浴勻(yun)漿。8000g 4℃離(li)心 10min，取上清，置冰上待(dai)測(ce)。

2、血(xue)清（漿）樣(yang)品(pin)：直(zhi)接檢測(ce)。

測(ce)定步(bu)驟：

1、分光(guang)光(guang)度(du)計預(yu)熱 30min 以上，調(tiao)節(jie)波(bo)長(chang)至 340nm，蒸餾(liu)水調(tiao)零。

2、將試(shi)劑(ji)二在(zai) 37℃（哺(bu)乳(ru)動物(wu)）或 25℃（其(qi)它物種(zhong)）水浴 10min 以(yi)上。

3、操作(zuo)表(biao)：

將上述(shu)試劑(ji)按順(shun)序(xu)加(jia)入(ru) 1 ml 石英比色皿(min)中，混(hun)勻(yun)後(hou)立即(ji)在(zai) 340 nm 波(bo)長(chang)下(xia)記(ji)錄初(chu)始吸光(guang)度(du) A1 和反應(ying) 1min

後的吸(xi)光(guang)度(du)A2，計算ΔA=A1-A2。

註意：若(ruo)A1-A2 大(da)於 0.5，需將樣(yang)本用(yong)提(ti)取液(ye)稀(xi)釋，使 A1-A2 小於 0.5，可提(ti)高(gao)檢測(ce)靈敏(min)度(du)。計算公(gong)式中(zhong)乘(cheng)以相(xiang)應稀(xi)釋倍(bei)數。

NAD-MDH 活力單(dan)位的計算：

1、血(xue)清（漿）NAD-MDH 活力的計算

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每毫升(sheng)血(xue)清（漿）每分鐘(zhong)消(xiao)耗 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹(yi)個酶活力單(dan)位。

NAD-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣(yang)÷T=6430×ΔA 2、組(zu)織(zhi)、細菌(jun)或細(xi)胞中 NAD-MDH 活力的計算:

按樣(yang)本蛋(dan)白(bai)濃度(du)計算：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每mg 組(zu)織(zhi)蛋白每(mei)分(fen)鐘(zhong)消(xiao)耗 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹(yi)個酶活力單(dan)位。

NAD-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本鮮(xian)重計算：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每g 組(zu)織(zhi)每分鐘(zhong)消(xiao)耗 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹(yi)個酶活力單(dan)位。

NAD-MDH（nmol/min/g 鮮(xian)重）=[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)）÷T =6430×ΔA÷W

按細菌(jun)或細(xi)胞密(mi)度(du)計算：

單(dan)位的定(ding)義(yi)：每 1 萬(wan)個細(xi)菌(jun)或細(xi)胞每分(fen)鐘(zhong)消(xiao)耗 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹(yi)個酶活力單(dan)位。

NAD-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷（2000×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)）÷T=3.215×ΔA

V 反總(zong)：反應(ying)體(ti)系總體(ti)積(ji)，8×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消(xiao)光(guang)系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿(min)光(guang)徑(jing)，1cm； V 樣(yang)：加(jia)入(ru)樣(yang)本體(ti)積(ji)，0.02ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入(ru)提取液(ye)體(ti)積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時間(jian)，1 min；W：樣(yang)本質量，g； Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白(bai)質濃度(du)，mg/ml；2000：細胞(bao)或細(xi)菌(jun)總數，2000 萬(wan)。

NAD-蘋果酸(suan)脫氫(qing)酶試(shi)劑盒 輔酶Ⅰ