MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存(cun)在於(yu)動物(wu)、植物(wu)、微生(sheng)物(wu)和(he)培(pei)養細(xi)胞(bao)中，線(xian)粒(li)體中MDH 是TCA 循(xun)環(huan)的(de)關(guan)鍵(jian)酶之(zhi)壹，催(cui)化蘋(ping)果(guo)酸形(xing)成草酰乙酸；相(xiang)反(fan)，胞(bao)漿(jiang)中 MDH 催(cui)化草(cao)酰乙酸形(xing)成蘋(ping)果(guo)酸。草酰乙酸是重要的中(zhong)間產物(wu)， 連接多(duo)條(tiao)重要的代(dai)謝途徑。
NADP-蘋(ping)果(guo)酸脫氫(qing)酶試(shi)劑盒(he) 輔(fu)酶

NADP-蘋(ping)果(guo)酸脫氫(qing)酶（NADP-MDH）試(shi)劑盒(he)說(shuo)明(ming)書

微量(liang)法 100 管/96 樣

NADP-蘋(ping)果(guo)酸脫氫(qing)酶試(shi)劑盒(he) 輔(fu)酶

正式(shi)測(ce)定前(qian)務(wu)必取(qu) 2-3 個預(yu)期差異較大(da)的(de)樣(yang)本(ben)做預測(ce)定測(ce)定意(yi)義(yi)：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存(cun)在於(yu)動物(wu)、植物(wu)、微生(sheng)物(wu)和(he)培(pei)養細(xi)胞(bao)中，線粒(li)體中MDH 是TCA 循(xun)環(huan)的(de)關(guan)鍵(jian)酶之(zhi)壹，催(cui)化蘋(ping)果(guo)酸形(xing)成草酰乙酸；相(xiang)反(fan)，胞(bao)漿(jiang)中 MDH 催(cui)化草(cao)酰乙酸形(xing)成蘋(ping)果(guo)酸。草酰乙酸是重要的中(zhong)間產物(wu)， 連接多(duo)條(tiao)重要的代(dai)謝途徑。因(yin)此，MDH 在細(xi)胞(bao)多種生(sheng)理活動(dong)中扮(ban)演著(zhe)重(zhong)要的角(jiao)色，包括(kuo)線(xian)粒(li)體的能量代(dai)謝、 蘋(ping)果(guo)酸-天(tian)冬(dong)an酸穿梭(suo)系統(tong)、活性氧(yang)代謝和(he)抗病性等(deng)。根(gen)據不同(tong)的輔(fu)酶特(te)異性，MDH分(fen)為NAD-依(yi)賴的MDH 和(he)NADP-依(yi)賴的MDH， NADP-MDH 主要存在於(yu)真(zhen)核(he)細(xi)胞(bao)中。

測(ce)定原理：

NADP-MDH 催(cui)化NADPH 還(hai)原草酰乙酸生(sheng)成蘋(ping)果(guo)酸，導致 340nm 處光吸收(shou)下降(jiang)。

組(zu)成：

自備(bei)儀(yi)器和(he)用(yong)品：

紫外分(fen)光光度計/酶標(biao)儀(yi)、臺(tai)式離(li)心(xin)機、水(shui)浴(yu)鍋(guo)、可調(tiao)式(shi)移(yi)液(ye)器(qi)、微量(liang)石英(ying)比(bi)色(se)皿/96 孔板和(he)蒸餾水(shui)。

樣本測(ce)定的(de)準(zhun)備(bei)：

1、細(xi)菌(jun)、細(xi)胞(bao)或組(zu)織樣品的制(zhi)備(bei)：

細(xi)菌(jun)或培(pei)養細(xi)胞(bao)：先收(shou)集細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)到離(li)心(xin)管內(nei)，離(li)心(xin)後棄上清；按(an)照(zhao)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)（104 個）：試(shi)劑壹體積（ml）為 500~1000：1 的比(bi)例（建議(yi) 500 萬(wan)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)加(jia)入(ru) 1ml 試(shi)劑壹），超(chao)聲(sheng)波(bo)破碎細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)（冰浴(yu)，功(gong)率 20％或 200W，超聲(sheng) 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重復(fu) 30 次）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清，置(zhi)冰(bing)上待測(ce)。

組(zu)織：按照(zhao)組(zu)織質(zhi)量（g）：試(shi)劑壹體積(ml)為 1：5~10 的比(bi)例（建議(yi)稱(cheng)取(qu)約 0.1g 組(zu)織，加(jia)入(ru) 1ml 試(shi)劑壹），進行(xing)冰(bing)浴勻漿(jiang)。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清，置(zhi)冰(bing)上待測(ce)。

2、血(xue)清(qing)（漿(jiang)）樣品：直接檢(jian)測(ce)。

測(ce)定步(bu)驟：

1、分(fen)光光度計或酶標(biao)儀(yi)預熱 30min 以(yi)上，調(tiao)節波(bo)長(chang)至 340nm，蒸餾水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、檢(jian)測(ce)工(gong)作(zuo)液(ye)的(de)配制(zhi)：用(yong)時(shi)在試(shi)劑三中(zhong)加(jia)入(ru) 19ml 試(shi)劑二和(he) 0.5ml 蒸餾水(shui)，充(chong)分(fen)混勻待用(yong)；用(yong)不完(wan)的試(shi)劑分(fen)裝後-20℃保(bao)存，禁止反復(fu)凍(dong)融；

3、測(ce)定前(qian)將(jiang)檢(jian)測(ce)工(gong)作(zuo)液(ye)在 37℃（哺(bu)乳(ru)動物(wu)）或 25℃（其(qi)它物(wu)種）水(shui)浴(yu) 10min 以(yi)上。

4、在微量(liang)石英(ying)比(bi)色(se)皿或 96 孔板中(zhong)加(jia)入(ru) 5μl 樣本和(he) 195μl 工(gong)作(zuo)液(ye)，混勻後立(li)即(ji)記錄 340nm 處(chu) 20s 時(shi)的(de)吸光值A1 和(he) 1min20s 後的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)A2，計(ji)算ΔA=A1-A2。

註(zhu)意(yi)：若A1-A2 大(da)於(yu) 0.5，需(xu)將(jiang)酶液(ye)用(yong)提(ti)取(qu)液(ye)稀(xi)釋(shi)，使 A1-A2 小(xiao)於(yu) 0.5，可提(ti)高(gao)檢(jian)測(ce)靈敏(min)度。計算公(gong)式中(zhong)乘(cheng)以(yi)相(xiang)應(ying)稀(xi)釋(shi)倍數(shu)。

NADP-MDH 活力(li)單(dan)位的計(ji)算：

用(yong)微量(liang)石英(ying)比(bi)色(se)皿測(ce)定的(de)計(ji)算公(gong)式如下

1、血(xue)清(qing)（漿(jiang)）NADP-MDH 活力(li)的計(ji)算

單(dan)位的定義(yi)：每毫升血(xue)清(qing)（漿(jiang)）每分(fen)鐘(zhong)消耗(hao) 1 nmol 的(de)NADPH 定義(yi)為壹個酶活力(li)單(dan)位。

NADP-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=6430×ΔA 2、組(zu)織、細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)中 NADP-MDH 活力(li)的計(ji)算:

按樣本蛋(dan)白濃度計算：

單(dan)位的定義(yi)：每mg 組(zu)織蛋(dan)白每分(fen)鐘(zhong)消耗(hao) 1 nmol 的(de)NADPH 定義(yi)為壹個酶活力(li)單(dan)位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

按樣本鮮(xian)重(zhong)計(ji)算：

單(dan)位的定義(yi)：每g 組(zu)織每分(fen)鐘(zhong)消耗(hao) 1 nmol 的(de)NADPH 定義(yi)為壹個酶活力(li)單(dan)位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V 樣÷V 樣(yang)總）÷T =6430×ΔA÷W

按細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)密(mi)度計算：

單(dan)位的定義(yi)：每 1 萬(wan)個細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)每分(fen)鐘(zhong)消耗(hao) 1 nmol 的(de)NADPH 定義(yi)為壹個酶活力(li)單(dan)位。

NADP-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（V 樣÷V 樣(yang)總×500）÷T=12.86×ΔA

V 反總：反應(ying)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光(guang)系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色(se)皿光徑(jing)， 1cm；V 樣：加(jia)入(ru)樣本體積，0.005ml；V 樣總：加(jia)入(ru)提取(qu)液(ye)體積，1ml；T：反應(ying)時(shi)間(jian)，1 min；W：樣本質(zhi)量，g；Cpr：樣本蛋(dan)白質(zhi)濃度，mg/ml；500：細(xi)胞(bao)或細(xi)菌(jun)總數(shu)，500 萬(wan)。

用(yong) 96 孔板測(ce)定的(de)計(ji)算公(gong)式如下

1、血(xue)清(qing)（漿(jiang)）NADP-MDH 活力(li)的計(ji)算

單(dan)位的定義(yi)：每毫升血(xue)清(qing)（漿(jiang)）每分(fen)鐘(zhong)消耗(hao) 1 nmol 的(de)NADPH 定義(yi)為壹個酶活力(li)單(dan)位。

NADP-MDH（nmol/min/ml）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=12860×ΔA 2、組(zu)織、細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)中 NADP-MDH 活力(li)的計(ji)算:

按樣本蛋(dan)白濃度計算：

單(dan)位的定義(yi)：每mg 組(zu)織蛋(dan)白每分(fen)鐘(zhong)消耗(hao) 1 nmol 的(de)NADPH 定義(yi)為壹個酶活力(li)單(dan)位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

按樣本鮮(xian)重(zhong)計(ji)算：

單(dan)位的定義(yi)：每g 組(zu)織每分(fen)鐘(zhong)消耗(hao) 1 nmol 的(de)NADPH 定義(yi)為壹個酶活力(li)單(dan)位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣(yang)總）÷T =12860×ΔA÷W

按細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)密(mi)度計算：

單(dan)位的定義(yi)：每 1 萬(wan)個細(xi)菌(jun)或細(xi)胞(bao)每分(fen)鐘(zhong)消耗(hao) 1 nmol 的(de)NADPH 定義(yi)為壹個酶活力(li)單(dan)位。

NADP-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣(yang)總）÷T=25.72×ΔA

V 反總：反應(ying)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光(guang)系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光(guang)徑(jing)， 0.5cm；V 樣：加(jia)入(ru)樣本體積，0.005ml；V 樣總：加(jia)入(ru)提取(qu)液(ye)體積，1ml；T：反應(ying)時(shi)間(jian)，1 min；W：樣本質(zhi)量，g；Cpr：樣本蛋(dan)白質(zhi)濃度，mg/ml；500：細(xi)胞(bao)或細(xi)菌(jun)總數(shu)，500 萬(wan)。

NADP-蘋(ping)果(guo)酸脫氫(qing)酶試(shi)劑盒(he) 輔(fu)酶