CS（EC 2.3.3.1）廣泛(fan)存在於動物(wu)、植(zhi)物(wu)、微生物(wu)和培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)的線(xian)粒(li)體(ti)基(ji)質(zhi)中，是(shi)三羧酸(suan)循(xun)環(huan)第壹(yi)個限(xian)速(su)酶，是(shi)三羧酸(suan)循(xun)環(huan)主要(yao)調控(kong)位點(dian)之(zhi)壹(yi)。
輔(fu)酶(mei)ⅡNADP(H)含(han)量(liang)測(ce)定(ding)試(shi)劑(ji)盒分(fen)光(guang)光(guang)度法(fa)

輔(fu)酶(mei)ⅡNADP(H)含(han)量(liang)測(ce)定(ding)試(shi)劑(ji)盒(分(fen)光(guang)光(guang)度法(fa)）

分(fen)光(guang)光度(du)法(fa)

輔(fu)酶(mei)ⅡNADP(H)含(han)量(liang)測(ce)定(ding)試(shi)劑(ji)盒分(fen)光(guang)光(guang)度法(fa)

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前務必取 2-3 個預(yu)期差(cha)異較(jiao)大(da)的樣(yang)本(ben)做(zuo)預測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意(yi)義(yi)：

CS（EC 2.3.3.1）廣(guang)泛(fan)存在於動物(wu)、植(zhi)物(wu)、微生物(wu)和培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)的線(xian)粒(li)體(ti)基(ji)質(zhi)中，是(shi)三羧酸(suan)循(xun)環(huan)第壹(yi)個限(xian)速(su)酶，是(shi)三羧酸(suan)循(xun)環(huan)主要(yao)調控(kong)位點(dian)之(zhi)壹(yi)。

測(ce)定(ding)原理：

CS 催(cui)化(hua)乙(yi)酰(xian)CoA 和(he)草酰(xian)乙(yi)酸產(chan)生(sheng)檸檬(meng)酰(xian)輔(fu)mei A，進(jin)壹(yi)步(bu)水(shui)解產(chan)生(sheng)檸檬(meng)酸；該反(fan)應促(cu)使(shi)無(wu)色(se)的(de)DTNB轉(zhuan)變成黃(huang)色(se)的TNB，在 412nm 處有特(te)征吸光值。

組(zu)成：

CE009-25T/12S 試(shi)劑(ji)六(liu)：粉(fen)劑(ji)×1 支(zhi)，-20℃保(bao)存，臨(lin)用(yong)前(qian)加(jia)入(ru) 1.2ml 蒸餾(liu)水，用(yong)不(bu)完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)仍-20℃保(bao)存；

CE009-50T/24S 試(shi)劑(ji)六(liu)：粉(fen)劑(ji)×1 支(zhi)，-20℃保(bao)存，臨(lin)用(yong)前(qian)加(jia)入(ru) 2.4ml 蒸餾(liu)水，用(yong)不(bu)完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)仍-20℃保(bao)存；

自(zi)備(bei)儀(yi)器(qi)和(he)用(yong)品(pin)：

可(ke)見分(fen)光(guang)光(guang)度計、臺(tai)式(shi)離(li)心(xin)機、水(shui)浴鍋(guo)、可(ke)調式(shi)移(yi)液(ye)器(qi)、1ml 玻(bo)璃(li)比色(se)皿、研缽、冰、無(wu)水(shui)乙(yi)醇(chun)和(he)蒸餾(liu)水

樣(yang)本(ben)的(de)前(qian)處理：

組(zu)織(zhi)、細(xi)菌或細(xi)胞(bao)中胞(bao)漿蛋白(bai)與線粒體(ti)蛋(dan)白(bai)的(de)分離(li)：

稱(cheng)取約(yue) 0.1g 組織(zhi)或(huo)收(shou)集(ji) 500 萬(wan)細(xi)胞(bao)，加入(ru) 1ml 試(shi)劑(ji)壹和(he) 10μl 試(shi)劑(ji)三，用(yong)冰浴勻(yun)漿器(qi)或(huo)研缽勻漿。將勻漿 600g，4℃離心(xin) 5min。

棄沈澱(dian)，將上清液移(yi)至另壹(yi)離心(xin)管中，11000g，4℃離(li)心(xin) 10min。

上(shang)清液即胞(bao)漿提取物(wu)，可(ke)用(yong)於測(ce)定(ding)從(cong)線(xian)粒(li)體(ti)泄(xie)漏的(de)CS（此步(bu)可(ke)選做(zuo)）。

在步(bu)驟④的(de)沈(chen)澱(dian)中加(jia)入(ru) 200μl 試(shi)劑(ji)二(er)和 2μl 試(shi)劑(ji)三，超聲(sheng)波(bo)破碎（冰浴，功(gong)率 20％或 200W，超聲(sheng) 3

秒，間隔(ge) 10 秒，重復(fu) 30 次），用(yong)於線粒(li)體(ti)CS 測(ce)定(ding)。

測(ce)定(ding)步(bu)驟：

1、分(fen)光(guang)光度(du)計或(huo)酶(mei)標(biao)儀(yi)預(yu)熱(re) 30min 以(yi)上，調節(jie)波長至 412nm，蒸餾(liu)水調(tiao)零(ling)。

2、樣(yang)本(ben)測(ce)定(ding)

在試(shi)劑(ji)五中(zhong)加(jia)入(ru) 0.6ml 無(wu)水(shui)乙(yi)醇(chun)和(he) 13ml 試(shi)劑(ji)四，混勻(yun)，37℃（哺乳(ru)動(dong)物(wu)）或 25℃（其(qi)它(ta)物(wu)種）孵育(yu) 5min；用(yong)不(bu)完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)分裝後-20℃保(bao)存，禁止反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)；

測(ce)定(ding)管：在EP 管中加(jia)入(ru) 40μl 樣(yang)本(ben)、880μl 試(shi)劑(ji)五和(he) 40μl 試(shi)劑(ji)六(liu)，混(hun)勻(yun)，37℃反(fan)應 15min 後立即測(ce)

定(ding)吸光值A1。

對照(zhao)管：在EP 管中加(jia)入(ru) 40μl 樣(yang)本(ben)、880μl 試(shi)劑(ji)四和 40μl 試(shi)劑(ji)六(liu)，混(hun)勻(yun)，37℃反(fan)應 15min 後立即測(ce)定(ding)吸光值A2。

計算(suan)ΔA=A1-A2，每個測(ce)定(ding)管設壹個對照(zhao)管。

CS 活(huo)性(xing)計算(suan)：

按樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)濃度計算(suan)：

單(dan)位(wei)的定(ding)義：每mg 組(zu)織(zhi)蛋(dan)白(bai)每分(fen)鐘催(cui)化(hua)產(chan)生(sheng) 1 nmol TNB 定(ding)義為壹個酶(mei)活力(li)單位(wei)。 CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr此(ci)法(fa)需(xu)要(yao)自(zi)行測(ce)定(ding)樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃度。

按樣(yang)本(ben)鮮(xian)重計算(suan)：

單(dan)位(wei)的定(ding)義：每g 組(zu)織(zhi)每分(fen)鐘催(cui)化(hua)產(chan)生(sheng) 1 nmol TNB 定(ding)義為壹個酶(mei)活力(li)單位(wei)。

CS（nmol/min /g 鮮(xian)重）=[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)）÷T=23.8×ΔA÷W

按細(xi)菌或細(xi)胞(bao)密(mi)度計算(suan)：

單(dan)位(wei)的定(ding)義：每 1 萬(wan)個細(xi)菌或細(xi)胞(bao)每分(fen)鐘催(cui)化(hua)產(chan)生(sheng) 1 nmol TNB 定(ding)義為壹個酶(mei)活力(li)單位(wei)。

CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)）÷T=0.0475×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反(fan)應體(ti)系總(zong)體(ti)積，9.6×10-4 L；ε：TNB 摩爾消(xiao)光(guang)系數(shu)，1.36×104 L / mol /cm；d：比色(se)皿光徑(jing)，1cm； V 樣(yang)：加(jia)入(ru)樣(yang)本(ben)體(ti)積，0.04 ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入(ru)提取液體(ti)積，0.202 ml；T：反應時(shi)間(jian)，15 min；Cpr：樣(yang)本(ben) 蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃度，mg/ml；W：樣(yang)本(ben)質(zhi)量(liang)，g；500：細(xi)胞(bao)或細(xi)菌總(zong)數(shu)，500 萬(wan)。

輔(fu)酶(mei)ⅡNADP(H)含(han)量(liang)測(ce)定(ding)試(shi)劑(ji)盒分(fen)光(guang)光(guang)度法(fa)