NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在(zai)於動(dong)物、植物、微生(sheng)物和培(pei)養(yang)細胞中(zhong)，可在氧(yang)氣(qi)存在(zai)下(xia)，直(zhi)接(jie)將NADH氧(yang)化為(wei)NAD。該酶(mei)不僅(jin)參與(yu)NAD 的(de)再(zai)生(sheng)，而且與(yu)免(mian)疫(yi)反(fan)應密切相關(guan)。
NADH 氧(yang)化酶(mei)試劑(ji)盒 輔(fu)酶(mei)Ⅰ

NADH 氧(yang)化酶(mei)（NADH oxidase，NOX）試劑(ji)盒說(shuo)明(ming)書(shu)

分(fen)光光度(du)法(fa) 50 管(guan)/48 樣(yang)

NADH 氧(yang)化酶(mei)試劑(ji)盒 輔(fu)酶(mei)Ⅰ

正(zheng)式(shi)測定前務(wu)必取(qu) 2-3 個(ge)預(yu)期差異較大的(de)樣(yang)本做(zuo)預(yu)測定測定意義(yi)：

NOX（EC 1.6.99.3）廣(guang)泛存在(zai)於動(dong)物、植物、微生(sheng)物和培(pei)養(yang)細胞中(zhong)，可在氧(yang)氣(qi)存在(zai)下(xia)，直(zhi)接(jie)將NADH氧(yang)化為(wei)NAD。該酶(mei)不僅(jin)參與(yu)NAD 的(de)再(zai)生(sheng)，而且與(yu)免(mian)疫(yi)反(fan)應密切相關(guan)。

測定原理(li)：

NOX 能(neng)夠將NADH 氧(yang)化為(wei)NAD，NADH 的(de)氧(yang)化與(yu) 2,6 二(er)lu酚(fen)靛藍（DCPIP）的(de)還(hai)原相偶(ou)聯(lian)，藍色(se)的(de)DCPIP 被(bei)還(hai)原為無(wu)色(se)的(de)DCPIP，在(zai) 600nm 下(xia)測定藍色(se)DCPIP 的(de)還(hai)原速率計算(suan)出(chu) NADH 氧(yang)化酶(mei)活性(xing)的(de)大(da)小(xiao)。

組成：

試(shi)劑(ji)六：粉(fen)劑(ji)×2 瓶(ping)，-20℃保(bao)存(cun)；臨用前每(mei)瓶(ping)加(jia)入 5ml 蒸(zheng)餾水；用不完的(de)試(shi)劑(ji)分(fen)裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止(zhi)反(fan)復凍(dong)融(rong)。

自(zi)備(bei)儀(yi)器和用品：

可見分(fen)光光度(du)計(ji)、臺式(shi)離心(xin)機、水浴鍋(guo)、可調式(shi)移(yi)液器、1ml 玻璃(li)比(bi)色(se)皿(min)、研缽(bo)、冰、蒸(zheng)餾水

樣(yang)本的(de)前(qian)處(chu)理(li)：

組織、細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)中(zhong)胞漿(jiang)蛋(dan)白(bai)與線粒體蛋白(bai)的(de)分(fen)離：

準確(que)稱取(qu) 0.1g 組織或(huo)收集(ji) 500 萬(wan)細胞(bao)，加(jia)入 1ml 試劑(ji)壹和 10μl 試劑(ji)三，用冰浴勻(yun)漿器或(huo)研缽(bo)勻(yun)漿。將勻(yun)漿 600g，4℃離心(xin) 5min。

棄沈(chen)澱，將上清液(ye)移(yi)至另壹離心(xin)管中(zhong)，11000g，4℃離心(xin) 10min。

上清液(ye)即為(wei)除(chu)去線粒體的(de)胞(bao)漿(jiang)蛋(dan)白(bai)，可用於測定從線粒體泄(xie)漏(lou)的(de)NOX（此步可選做(zuo)）。

步驟④中(zhong)的(de)沈(chen)澱即(ji)為線粒體，加(jia)入 200μl 試劑(ji)二(er)和(he) 2μl 試劑(ji)三，超(chao)聲波(bo)破(po)碎(sui)（冰(bing)浴，功(gong)率 20％或(huo) 200W，超(chao)聲 3s，間隔 10 秒(miao)，重(zhong)復 30 次），用於NOX 活(huo)性(xing)測定。

血(xue)清（漿）樣(yang)品：直(zhi)接檢(jian)測。

測定步驟：

1、分(fen)光光度(du)計(ji)預(yu)熱(re) 30min 以上，調節波長至 600nm，蒸(zheng)餾水調零(ling)。

2、樣(yang)本測定

試(shi)劑(ji)四、試(shi)劑(ji)五和(he)試劑(ji)六於 37℃（哺乳(ru)動(dong)物）或(huo) 25℃（其(qi)它(ta)物種）孵育(yu) 5min。

在(zai) 1ml 石英比(bi)色(se)皿(min)中(zhong)加(jia)入 40μl 樣(yang)本、700μl 試(shi)劑(ji)四、100μl 試(shi)劑(ji)五和(he) 160μl 試劑(ji)六，混勻(yun)，記錄 600nm

處(chu) 20s 時吸光值A1 和 1min20s 後(hou)的(de)吸(xi)光值A2，計算(suan)ΔA=A1-A2。

NOX 活(huo)力(li)單(dan)位的(de)計(ji)算(suan):

1、血(xue)清（漿）NOX 活力(li)的(de)計(ji)算(suan):

單(dan)位的(de)定義(yi)：每(mei)ml 血清(qing)（漿(jiang)）在(zai)每(mei)ml 反(fan)應體(ti)系中(zhong)每(mei)分(fen)鐘A600 變化 0.01 定義(yi)為壹個酶(mei)活力(li)單(dan)位。

NOX（U/ml）＝ΔA×V 反(fan)總(zong)÷V 樣(yang)÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)中(zhong) NOX 活力(li)的(de)計(ji)算(suan):

按(an)樣(yang)本蛋(dan)白(bai)濃度(du)計(ji)算(suan)：

單(dan)位的(de)定義(yi)：每(mei)mg 組織蛋(dan)白(bai)在每(mei)ml 反(fan)應體(ti)系中(zhong)每(mei)分(fen)鐘A600 變化 0.01 定義(yi)為壹個酶(mei)活力(li)單(dan)位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（V 樣(yang)×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr此法(fa)需(xu)要自(zi)行測定樣(yang)本蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃度(du)。

按(an)樣(yang)本鮮(xian)重計(ji)算(suan)：

單(dan)位的(de)定義(yi)：每(mei)g 組織在(zai)每(mei)ml 反(fan)應體(ti)系中(zhong)每(mei)分(fen)鐘A600 變化 0.01 定義(yi)為壹個酶(mei)活力(li)單(dan)位。

NOX（U/g 鮮(xian)重）=ΔA×V 反(fan)總(zong)÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷0.01÷T=505×ΔA÷W

按(an)細菌或(huo)細胞(bao)密度(du)計(ji)算(suan)：

單(dan)位的(de)定義(yi)：每(mei) 1 萬(wan)個細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)在每(mei) ml 反(fan)應體(ti)系中(zhong)每(mei)分(fen)鐘 A600 變化 0.01 定義(yi)為壹個酶(mei)活力(li)單(dan)位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V 反(fan)總(zong)÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷0.01÷T=1.01×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反(fan)應體(ti)系總(zong)體積，1ml； V 樣(yang)：加(jia)入樣(yang)本體(ti)積，0.04ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提(ti)取(qu)液(ye)體積，0.202 ml；T：反(fan)應時(shi)間，1 min；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)；500：細(xi)胞(bao)或(huo)細菌(jun)總(zong)數，500 萬(wan)。

NADH 氧(yang)化酶(mei)試劑(ji)盒 輔(fu)酶(mei)Ⅰ