NOX（EC 1.6.99.3）廣(guang)泛(fan)存(cun)在於動(dong)物(wu)、植(zhi)物(wu)、微生物(wu)和(he)培養(yang)細胞中(zhong)，可(ke)在氧(yang)氣存在下(xia)，直(zhi)接(jie)將(jiang)NADH氧(yang)化(hua)為NAD。該(gai)酶(mei)不(bu)僅參與(yu)NAD 的再(zai)生，而(er)且(qie)與(yu)免(mian)疫(yi)反(fan)應密(mi)切(qie)相關。
NADH 氧(yang)化(hua)酶(mei)oxidase NOX試劑盒(he) 輔酶(mei)Ⅰ

NADH 氧(yang)化(hua)酶(mei)（NADH oxidase，NOX）試劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

分光光度法 50 管/48 樣

NADH 氧(yang)化(hua)酶(mei)oxidase NOX試劑盒(he) 輔酶(mei)Ⅰ

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前務必取 2-3 個(ge)預期差異較(jiao)大的樣本做預測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意(yi)義：

NOX（EC 1.6.99.3）廣(guang)泛(fan)存(cun)在於動(dong)物(wu)、植(zhi)物(wu)、微生物(wu)和(he)培養(yang)細胞中(zhong)，可(ke)在氧(yang)氣存在下(xia)，直(zhi)接(jie)將(jiang)NADH氧(yang)化(hua)為NAD。該(gai)酶(mei)不(bu)僅參與(yu)NAD 的再(zai)生，而(er)且(qie)與(yu)免(mian)疫(yi)反(fan)應密(mi)切(qie)相關。

測(ce)定(ding)原(yuan)理：

NOX 能(neng)夠將(jiang)NADH 氧(yang)化(hua)為NAD，NADH 的氧(yang)化(hua)與 2,6 二(er)lu酚靛(dian)藍（DCPIP）的還原(yuan)相(xiang)偶(ou)聯，藍色的DCPIP 被(bei)還原(yuan)為(wei)無(wu)色的DCPIP，在 600nm 下(xia)測(ce)定(ding)藍色DCPIP 的還原(yuan)速(su)率計算(suan)出(chu) NADH 氧(yang)化(hua)酶(mei)活(huo)性(xing)的大(da)小。

組成：

試劑六：粉(fen)劑(ji)×2 瓶(ping)，-20℃保存(cun)；臨用前每瓶(ping)加入(ru) 5ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)；用不(bu)完(wan)的試劑分裝後-20℃保存(cun)，禁止(zhi)反(fan)復凍(dong)融(rong)。

自(zi)備儀器(qi)和(he)用品(pin)：

可(ke)見(jian)分光光度計、臺式離心(xin)機(ji)、水浴鍋(guo)、可(ke)調式移(yi)液器(qi)、1ml 玻璃(li)比(bi)色皿(min)、研缽、冰(bing)、蒸(zheng)餾(liu)水(shui)

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中(zhong)胞漿(jiang)蛋白與(yu)線(xian)粒體蛋(dan)白的分離：

準(zhun)確稱取(qu) 0.1g 組織或收集(ji) 500 萬細胞，加(jia)入(ru) 1ml 試劑壹和(he) 10μl 試劑三，用冰(bing)浴勻(yun)漿(jiang)器(qi)或研缽勻(yun)漿(jiang)。將(jiang)勻(yun)漿(jiang) 600g，4℃離心(xin) 5min。

棄沈(chen)澱(dian)，將(jiang)上清液移至另(ling)壹(yi)離心(xin)管中(zhong)，11000g，4℃離心(xin) 10min。

上清液即為除去(qu)線粒體的胞漿(jiang)蛋白，可(ke)用於測(ce)定(ding)從(cong)線粒體泄(xie)漏的NOX（此(ci)步可(ke)選做）。

步(bu)驟(zhou)④中(zhong)的沈(chen)澱(dian)即(ji)為線粒體，加(jia)入(ru) 200μl 試劑二和(he) 2μl 試劑三，超(chao)聲(sheng)波(bo)破碎(sui)（冰(bing)浴，功(gong)率 20％或 200W，超(chao)聲(sheng) 3s，間隔 10 秒(miao)，重(zhong)復 30 次(ci)），用於NOX 活(huo)性(xing)測(ce)定(ding)。

血清（漿(jiang)）樣品(pin)：直(zhi)接(jie)檢(jian)測(ce)。

測(ce)定(ding)步(bu)驟：

1、分光光度計預熱 30min 以(yi)上，調節波(bo)長至 600nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調零。

2、樣本測(ce)定(ding)

試劑四、試劑五和(he)試劑六於 37℃（哺(bu)乳(ru)動(dong)物(wu)）或 25℃（其它物(wu)種(zhong)）孵(fu)育 5min。

在 1ml 石(shi)英(ying)比(bi)色皿(min)中(zhong)加(jia)入(ru) 40μl 樣本、700μl 試劑四、100μl 試劑五和(he) 160μl 試劑六，混(hun)勻(yun)，記(ji)錄 600nm

處 20s 時吸(xi)光值A1 和(he) 1min20s 後的吸(xi)光值A2，計算(suan)ΔA=A1-A2。

NOX 活(huo)力(li)單(dan)位的計算(suan):

1、血清（漿(jiang)）NOX 活(huo)力(li)的計算(suan):

單(dan)位的定(ding)義：每ml 血清（漿(jiang)）在每(mei)ml 反(fan)應體系(xi)中(zhong)每(mei)分鐘A600 變化(hua) 0.01 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

NOX（U/ml）＝ΔA×V 反(fan)總÷V 樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細菌或細胞中(zhong) NOX 活(huo)力(li)的計算(suan):

按樣本蛋白濃(nong)度計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義：每mg 組織蛋白在每(mei)ml 反(fan)應體系(xi)中(zhong)每(mei)分鐘A600 變化(hua) 0.01 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V 反(fan)總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr此(ci)法需(xu)要(yao)自(zi)行(xing)測(ce)定(ding)樣本蛋白質(zhi)濃(nong)度。

按樣本鮮(xian)重計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義：每g 組織在每(mei)ml 反(fan)應體系(xi)中(zhong)每(mei)分鐘A600 變化(hua) 0.01 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

NOX（U/g 鮮(xian)重）=ΔA×V 反(fan)總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

按細菌或細胞密(mi)度計算(suan)：

單(dan)位的定(ding)義：每 1 萬(wan)個(ge)細菌或細胞在每(mei) ml 反(fan)應體系(xi)中(zhong)每(mei)分鐘 A600 變化(hua) 0.01 定義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V 反(fan)總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V 反(fan)總：反(fan)應體系(xi)總體積(ji)，1ml； V 樣：加入(ru)樣本體積(ji)，0.04ml；V 樣總：加入(ru)提取液體積(ji)，0.202 ml；T：反(fan)應時間(jian)，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhi)濃(nong)度，mg/ml；W：樣本質量；500：細胞或細菌總數，500 萬(wan)。

NADH 氧(yang)化(hua)酶(mei)oxidase NOX試劑盒(he) 輔酶(mei)Ⅰ