輔(fu)酶ⅡNADP(H)廣(guang)泛(fan)存(cun)在(zai)於動(dong)物、植(zhi)物、微生(sheng)物和(he)培養細(xi)胞中(zhong)，NADP+和(he) NADPH 含量(liang)測(ce)定(ding)可以計(ji)算NADP（NADPH + NADP+ )含量(liang)和(he) NADPH/NADP+比值，其(qi)變化(hua)與(yu)磷(lin)酸(suan)戊(wu)糖途徑(jing)和(he)生(sheng)物合(he)成(cheng)以及抗(kang)氧(yang)化(hua)反應密切(qie)相(xiang)關。NADPH/NADP+比值不(bu)僅(jin)是細(xi)胞氧化(hua)還(hai)原態(tai)的主(zhu)要標誌(zhi)之(zhi)壹，而且(qie)在(zai) PPP 途徑(jing)、生(sheng)物合(he)成(cheng)和(he)抗氧化(hua)代謝中(zhong)具有重(zhong)要調控(kong)作(zuo)用。
輔(fu)酶ⅡNADP(H)含量(liang)試(shi)劑(ji)盒 輔(fu)酶Ⅱ

輔(fu)酶ⅡNADP(H)含量(liang)試(shi)劑(ji)盒說明書(shu)

分光(guang)光(guang)度法 50 管/24 樣

輔(fu)酶ⅡNADP(H)含量(liang)試(shi)劑(ji)盒 輔(fu)酶Ⅱ

正(zheng)式測(ce)定前務(wu)必取(qu) 2-3 個(ge)預期(qi)差異(yi)較(jiao)大(da)的樣本(ben)做預測(ce)定測(ce)定(ding)意(yi)義：

輔(fu)酶ⅡNADP(H)廣(guang)泛(fan)存(cun)在(zai)於動(dong)物、植(zhi)物、微生(sheng)物和(he)培養細(xi)胞中(zhong)，NADP+和(he) NADPH 含量(liang)測(ce)定(ding)可以計(ji)算NADP（NADPH + NADP+ )含量(liang)和(he) NADPH/NADP+比值，其(qi)變化(hua)與(yu)磷(lin)酸(suan)戊(wu)糖途徑(jing)和(he)生(sheng)物合(he)成(cheng)以及抗(kang)氧(yang)化(hua)反應密切(qie)相(xiang)關。NADPH/NADP+比值不(bu)僅(jin)是細(xi)胞氧化(hua)還(hai)原態(tai)的主(zhu)要標誌(zhi)之(zhi)壹，而且(qie)在(zai) PPP 途徑(jing)、生(sheng)物合(he)成(cheng)和(he)抗氧化(hua)代謝中(zhong)具有重(zhong)要調控(kong)作(zuo)用。

測定(ding)原理：

分別用酸(suan)性(xing)和(he)堿性(xing)提取(qu)液提取(qu)樣品中(zhong) NADP+和(he)NADPH。NADPH 通過PMS 的遞(di)氫(qing)作用，使氧化(hua)型噻(sai)唑(zuo)藍（MTT）還(hai)原為(wei)甲瓚(zan)，570nm 下檢(jian)測吸(xi)光(guang)值，從而(er)測(ce)定(ding)NADPH 含量(liang)。利(li)用(yong) 6-磷(lin)酸(suan)葡萄(tao)糖脫(tuo)氫(qing)酶還(hai)原NADP+為(wei)NADPH，從而(er)檢(jian)測(ce)NADP+含量(liang)。

組成：

試劑(ji)二(er)：粉劑(ji)×1 支(zhi)，-20 ℃保(bao)存(cun)，用(yong)時(shi)加(jia)入(ru) 4ml 蒸餾(liu)水(shui)，混(hun)勻；用(yong)不(bu)完(wan)的試(shi)劑(ji) 4℃保存(cun)壹(yi)周；試劑(ji)三：粉劑(ji)×1 支(zhi)，-20℃保(bao)存(cun)，用(yong)時(shi)加(jia)入(ru) 4ml 蒸餾(liu)水(shui)，混(hun)勻；用(yong)不(bu)完(wan)的試(shi)劑(ji) 4℃保存(cun)壹(yi)周；試劑(ji)四：粉劑(ji)×1 支(zhi)，4 ℃保(bao)存(cun)，用(yong)時(shi)加(jia)入(ru) 4ml 蒸餾(liu)水(shui)，混(hun)勻；用(yong)不(bu)完(wan)的試(shi)劑(ji) 4℃保存(cun)壹(yi)周；

自(zi)備儀器和(he)用品：

可見(jian)分光(guang)光(guang)度計、臺式離心(xin)機(ji)、可調(tiao)式(shi)移液器、1 ml 玻(bo)璃(li)比色(se)皿(min)、研(yan)缽(bo)、冰和(he)蒸餾(liu)水(shui)。

NADP+和(he) NADPH 的提取(qu)：

1、 血清(qing)（漿(jiang)）中(zhong) NADP+和(he)NADPH 的提取(qu)

NADP+的提取(qu)：按照(zhao)血(xue)清(qing)（漿(jiang)）體積(ji)（ml）：酸(suan)性(xing)提取(qu)液體積(ji)（ml）為(wei) 1：5~10 的比例（建議(yi)取(qu)約(yue) 0.1ml

血清(qing)（漿(jiang)），加(jia)入(ru) 1ml 酸(suan)性(xing)提取(qu)液），95℃水(shui)浴 5min（蓋緊(jin)，以防(fang)止水(shui)分散失(shi)）；冰浴中(zhong)冷(leng)卻(que)後，10000g 4 ℃離心(xin) 10min；取(qu) 500μl 上清(qing)液，加(jia)入(ru) 500μl 堿性(xing)提取(qu)液使之(zhi)中(zhong)和(he)，混勻，10000g 4 ℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置冰上待(dai)測。

NADPH 的提取(qu)：按照(zhao)血(xue)清(qing)（漿(jiang)）體積(ji)（ml）：堿(jian)性(xing)提取(qu)液體積(ji)（ml）為(wei) 1：5~10 的比例（建議(yi)取(qu)約(yue) 0.1ml

血清(qing)（漿(jiang)），加(jia)入(ru) 1ml 堿性(xing)提取(qu)液），95℃水(shui)浴 5min（蓋緊(jin)，以防(fang)止水(shui)分散失(shi)）；冰浴中(zhong)冷(leng)卻(que)後，10000g 4 ℃離心(xin) 10min；取(qu) 500μl 上清(qing)液，加(jia)入(ru) 500μl 酸(suan)性(xing)提取(qu)液使之(zhi)中(zhong)和(he)，混勻，10000g 4 ℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置冰上待(dai)測。

2、組織(zhi)中(zhong)NADP+和(he)NADPH 的提取(qu)：

NADP+的提取(qu)：按照(zhao)組織(zhi)質量(liang)（g）：酸(suan)性(xing)提取(qu)液體積(ji)（ml）為(wei) 1：5~10 的比例（建議(yi)取(qu)約(yue) 0.1g 組織(zhi)，加(jia)

入(ru) 1ml 酸(suan)性(xing)提取(qu)液），冰浴研(yan)磨(mo)，95℃水(shui)浴 5min（蓋緊(jin)，以防(fang)止水(shui)分散失(shi)）；冰浴中(zhong)冷(leng)卻(que)後，10000g 4 ℃離心(xin) 10min；取(qu) 500μl 上清(qing)液，加(jia)入(ru) 500μl 堿性(xing)提取(qu)液使之(zhi)中(zhong)和(he)，混勻，10000g 4 ℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置冰上待(dai)測。

NADPH 的提取(qu)：按照(zhao)組織(zhi)質量(liang)（g）：堿(jian)性(xing)提取(qu)液體積(ji)（ml）為(wei) 1：5~10 的比例（建議(yi)取(qu)約(yue) 0.1g 組織(zhi)，

加(jia)入(ru) 1ml 堿性(xing)提取(qu)液），冰浴研(yan)磨(mo)，95℃水(shui)浴 5min（蓋緊(jin)，以防(fang)止水(shui)分散失(shi)）；冰浴中(zhong)冷(leng)卻(que)後，10000g 4 ℃離心(xin) 10min；取(qu) 500μl 上清(qing)液，加(jia)入(ru) 500μl 酸(suan)性(xing)提取(qu)液使之(zhi)中(zhong)和(he)，混勻，10000g 4 ℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置冰上待(dai)測。

3 、細(xi)胞或(huo)細(xi)菌中(zhong) NADP+和(he)NADPH 的提取(qu)：

NADP+的提取(qu)：先收集細(xi)胞或(huo)細(xi)菌到(dao)離(li)心(xin)管(guan)內，棄上清(qing)，按照(zhao)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞數量(liang)（104 個(ge)）：酸(suan)性(xing)提取(qu)液體

積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的比例（建議(yi) 500 萬(wan)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞加(jia)入(ru) 1ml 酸(suan)性(xing)提取(qu)液），超聲波(bo)破(po)碎（冰(bing)浴，功(gong)率 20％或(huo) 200W，超(chao)聲 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重復(fu) 30 次），95℃水(shui)浴 5min（蓋緊(jin)，以防(fang)止水(shui)分散失(shi)）；冰浴中(zhong)冷(leng)卻(que)後，10000g 4 ℃離心(xin) 10min；取(qu) 500μl 上清(qing)液，加(jia)入(ru) 500μl 堿性(xing)提取(qu)液使之(zhi)中(zhong)和(he)，混勻，10000g 4 ℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置冰上待(dai)測。

NADPH 的提取(qu)：先收集細(xi)胞或(huo)細(xi)菌到(dao)離(li)心(xin)管(guan)內，棄上清(qing)，按照(zhao)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞數量(liang)（104 個(ge)）：堿(jian)性(xing)提取(qu)液體

積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的比例（建議(yi) 500 萬(wan)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞加(jia)入(ru) 1ml 堿性(xing)提取(qu)液），超聲波(bo)破(po)碎（冰(bing)浴，功(gong)率 20％或(huo) 200W，超(chao)聲 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重復(fu) 30 次），95℃水(shui)浴 5min（蓋緊(jin)，以防(fang)止水(shui)分散失(shi)）；冰浴中(zhong)冷(leng)卻(que)後，10000g 4 ℃離心(xin) 10min；取(qu) 500μl 上清(qing)液，加(jia)入(ru) 500μl 酸(suan)性(xing)提取(qu)液使之(zhi)中(zhong)和(he)，混勻，10000g 4 ℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清(qing)，置冰上待(dai)測。

測定(ding)步驟(zhou)：

1、分光(guang)光(guang)度計預熱(re) 30min 以上，調(tiao)節波(bo)長(chang)至 570nm，蒸餾(liu)水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、加(jia)樣表(在 1.5ml 棕色(se)EP 管(guan)中(zhong)按下(xia)表依次(ci)加(jia)樣）：

充分混勻，靜(jing)置 5min 後，20000g，25℃離(li)心(xin) 5min，棄上清(qing)，沈澱中(zhong)加(jia)入(ru)：

混勻，570nm 下比色(se)，讀取(qu)對(dui)照吸光(guang)值A1 和(he)測定管(guan)吸光(guang)值 A2，計(ji)算△A=A2-A1。

註(zhu)意(yi)事項(xiang)

1、如果壹次(ci)性(xing)測(ce)定樣本(ben)數較(jiao)多，可將試(shi)劑(ji)壹、二(er)、三和(he)四按比例配(pei)成(cheng)混(hun)合(he)液。

2、對(dui)照管和(he)測定管(guan)的測(ce)定步驟(zhou)的區(qu)別：對(dui)照管加(jia)完(wan)試劑(ji)壹、二(er)、三、四和(he)五後必須馬(ma)上加(jia)試(shi)劑(ji)六(liu)；測定管加(jia)完(wan)試劑(ji)壹、二(er)、三、四和(he)五後必須反應 20min 後再加(jia)試(shi)劑(ji)六(liu)。

3、反應過程(cheng)中(zhong)註(zhu)意(yi)避(bi)光(guang)。

4、若NADP⁺測(ce)定中(zhong)△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 測定(ding)中(zhong)△A（A2-A1）≤0.0259，說明樣本(ben)中(zhong)輔(fu)酶含量(liang)較低，已(yi)低於檢(jian)測限，可做(zuo)如下調整：（1）將測(ce)定(ding)管(guan)避(bi)光(guang)靜(jing)置時(shi)間(jian) 20min 延長到(dao) 60min；（2）在(zai)提取(qu)階段增加(jia)取(qu)樣量(liang)，即(ji)取(qu) 0.2g 樣本(ben)或(huo) 0.2ml 樣本(ben)加(jia)入(ru) 1ml 提取(qu)液。

5、由於每(mei)壹個(ge)測定管(guan)需要設(she)壹個(ge)對(dui)照管，本(ben)試劑(ji)盒 50 管保(bao)證測(ce) 24 個NADP⁺或(huo)NADPH。

NADP+和(he) NADPH 含量(liang)的計(ji)算：

（壹）NADP⁺含量(liang)的計(ji)算

標準條(tiao)件(jian)下的回歸(gui)曲(qu)線(xian)為(wei)y = 0.197x + 0.0144，R² = 0.9998；其中(zhong)y 為(wei)△A，x 為(wei)NADP⁺濃度nmol/ml 1、血(xue)清（漿(jiang)）中(zhong) NADP⁺含量(liang)計(ji)算

NADP⁺含量(liang)(nmol/ml）=[ (△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 101.5×(△A -0.0144）

2、組織(zhi)、細(xi)菌或(huo)細(xi)胞中(zhong) NADP⁺含量(liang)計(ji)算 (1)按樣本(ben)蛋白(bai)濃度計(ji)算

NADP⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V1×Cpr)= 5.1×(△A -0.0144）÷Cpr

按樣本(ben)鮮重計算

NADP⁺ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(W×V1÷V2)=10.2×(△A -0.0144）÷W

按細(xi)菌或(huo)細(xi)胞密度(du)計(ji)算

NADP⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.02×(△A -0.0144）

（二(er)）NADPH 含量(liang)的計(ji)算

標準條(tiao)件(jian)下的回歸(gui)曲(qu)線(xian)為(wei)y = 1.2396x + 0.0259，R² = 0.9977；其中(zhong)y 為(wei)△A，x 為(wei)NADPH 濃度nmol/ml 1、血(xue)清（漿(jiang)）中(zhong) NADPH 含量(liang)計(ji)算

NADPH 含量(liang)(nmol/ml）= [(△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259）

2、組織(zhi)、細(xi)菌或(huo)細(xi)胞中(zhong) NADPH 含量(liang)計(ji)算

按樣本(ben)蛋白(bai)濃度計(ji)算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr

按樣本(ben)鮮重計算

NADPH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259）÷W

按細(xi)菌或(huo)細(xi)胞密度(du)計(ji)算

NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）

V1：加(jia)入(ru)反應體系中(zhong)樣本(ben)體積(ji)，0.05ml；V2：加(jia)入(ru)提取(qu)液體積(ji)，2ml；V3：加(jia)入(ru)血清(qing)（漿(jiang)）體積(ji)：0.1ml； Cpr：樣本(ben)蛋白(bai)質濃度，mg/ml；W：樣本(ben)質量(liang)，g；500：細(xi)胞或(huo)細(xi)菌總(zong)數，500 萬(wan)。

註(zhu)意(yi)：最di檢(jian)測(ce)限為(wei) 0.01nmol/ml 或(huo) 0.01nmol/g 鮮重 或(huo) 0.001nmol/mg prot

輔(fu)酶ⅡNADP(H)含量(liang)試(shi)劑(ji)盒 輔(fu)酶Ⅱ