ME 廣(guang)泛存(cun)在(zai)於微(wei)生物(wu)、培(pei)養(yang)細(xi)胞、動物(wu)和植(zhi)物(wu)胞漿(jiang)中(zhong)，尤(you)其在(zai)植(zhi)物(wu)組織中活性(xing)較(jiao)高。ME 催化蘋果酸氧化脫(tuo)羧(suo)的可逆(ni)反應(ying)，產生丙酮(tong)酸和CO2，以及伴(ban)隨(sui)NAD(P)+的還原(yuan)反應(ying)，是蘋果酸代謝的關(guan)鍵酶(mei)。 ME 活(huo)性與生物(wu)合成(cheng)和(he)抗(kang)氧化密切相(xiang)關(guan)。
NAD-蘋果酸酶試(shi)劑(ji)盒(he) 輔酶Ⅱ

NAD-蘋果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）試(shi)劑(ji)盒(he)說明書(shu)

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)法 50 管/48 樣(yang)

NAD-蘋果酸酶試(shi)劑(ji)盒(he) 輔酶Ⅱ

正(zheng)式測(ce)定前(qian)務(wu)必取 2-3 個預期差異較(jiao)大(da)的樣本做(zuo)預測(ce)定測(ce)定意(yi)義(yi)：

ME 廣(guang)泛存(cun)在(zai)於微(wei)生物(wu)、培(pei)養(yang)細(xi)胞、動物(wu)和植(zhi)物(wu)胞漿(jiang)中(zhong)，尤(you)其在(zai)植(zhi)物(wu)組織中活性(xing)較(jiao)高。ME 催化蘋果酸氧化脫(tuo)羧(suo)的可逆(ni)反應(ying)，產生丙酮(tong)酸和CO2，以(yi)及伴(ban)隨(sui)NAD(P)+的還原(yuan)反應(ying)，是蘋果酸代謝的關(guan)鍵酶(mei)。 ME 活(huo)性與(yu)生物(wu)合成(cheng)和(he)抗(kang)氧化密切相(xiang)關(guan)。近(jin)年來(lai)植(zhi)物(wu) ME 活性測定較(jiao)多，已(yi)經成(cheng)為(wei)抗(kang)氧化研(yan)究的熱(re)點(dian)。根(gen)據(ju)輔酶專壹性(xing)和(he)對底物(wu)特異性(xing)的不(bu)同(tong)，可(ke)將(jiang)ME 分(fen)為(wei)NAD-ME(EC1.1.1.38)和(he)NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測(ce)定原(yuan)理(li)：

NAD-ME 催化NAD+還原(yuan)成(cheng)NADH，在(zai) 340nm 下(xia)測定NADH 增(zeng)加速率(lv)。

組成(cheng)：

試(shi)劑(ji)三(san)：粉劑(ji)×1 支，4℃保(bao)存(cun)；用(yong)時加 2ml 蒸餾(liu)水充分(fen)溶解(jie)備用(yong)；用(yong)不(bu)完(wan)的試(shi)劑(ji)分(fen)裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁止反復凍融。

試(shi)劑(ji)四：粉(fen)劑(ji)×1 支，-20℃保(bao)存(cun)；用(yong)時加 1ml 蒸餾(liu)水充分(fen)溶解(jie)備用(yong)；用(yong)不(bu)完(wan)的試(shi)劑(ji)分(fen)裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁止反復凍融。

自(zi)備儀器(qi)和(he)用(yong)品：

紫(zi)外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、水浴鍋、臺(tai)式離(li)心(xin)機、可調(tiao)式移液(ye)器、1 ml 石(shi)英(ying)比色(se)皿(min)和蒸餾(liu)水。

樣(yang)本的前(qian)處(chu)理(li)：

1、細(xi)菌(jun)、細胞或組織樣品的制備：

細(xi)菌(jun)或培(pei)養(yang)細(xi)胞：先收集(ji)細菌(jun)或細(xi)胞到離(li)心(xin)管內，離(li)心(xin)後棄(qi)上清(qing)；按(an)照細菌(jun)或細(xi)胞數量(liang)（104 個）：提取液(ye)體積(ji)（ml）為 500~1000：1 的比例(li)（建(jian)議 500 萬(wan)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞加入 1ml 提(ti)取液(ye)），超聲波破(po)碎(sui)細(xi)菌(jun)或細(xi)胞

（冰浴(yu)，功(gong)率(lv) 20％或(huo) 200W，超聲 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重復(fu) 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上清(qing)，置(zhi)冰上待(dai)測(ce)。

組織：按照組織質量（g）：提(ti)取液(ye)體積(ji)(ml)為 1：5~10 的比例(li)（建(jian)議稱(cheng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提(ti)取液(ye)），進行(xing)冰浴(yu)勻(yun)漿(jiang)。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上清(qing)，置(zhi)冰上待(dai)測(ce)。

2、血(xue)清（漿(jiang)）樣(yang)品(pin)：直接檢測。

測(ce)定步(bu)驟(zhou)：

1、分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計預(yu)熱(re) 30min 以(yi)上，調(tiao)節波長至 340nm，蒸餾(liu)水調(tiao)零。

2、將(jiang)試(shi)劑(ji)壹(yi)、二、三和四置(zhi)於(yu) 37℃（哺乳動物(wu)）或 25℃（其它(ta)物(wu)種）水浴 10min 以(yi)上。如(ru)果壹次性測(ce)定樣(yang)本較多(duo)，可將(jiang)試(shi)劑(ji)壹(yi)、二、三和四按(an)下(xia)表比例(li)配(pei)成(cheng)混(hun)合液(ye)後置(zhi)於(yu) 37℃（哺乳動物(wu)）或 25℃（其它(ta)物(wu)種）水浴 10min 以(yi)上（現配現用(yong)）。

3、操(cao)作(zuo)表：

將(jiang)上述試(shi)劑(ji)按(an)順序加入 1 ml 石(shi)英(ying)比色(se)皿(min)中，混(hun)勻(yun)，立即記(ji)錄 340 nm 波長下初(chu)始(shi)吸光度(du)A1 和反應(ying) 1min

後(hou)的吸光度(du)A2，計算(suan)ΔA=A2-A1。

註意：如(ru)果ΔA＜0.005，可將反應(ying)時間(jian)延(yan)長到 2 分(fen)鐘(zhong)或(huo) 5 分(fen)鐘(zhong)。

NAD-ME 活(huo)性計(ji)算：

按(an)樣本(ben)蛋(dan)白(bai)濃度(du)計算(suan)：

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)mg 組織蛋(dan)白(bai)每(mei)分(fen)鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol NADH 定義(yi)為(wei)壹(yi)個酶活力單(dan)位(wei)。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr

此(ci)法需(xu)要自(zi)行(xing)測定樣(yang)本蛋(dan)白(bai)質濃度(du)。

按(an)樣本(ben)鮮重計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei)g 組織每(mei)分(fen)鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol NADH 定義(yi)為(wei)壹(yi)個酶活力單(dan)位(wei)。

NAD-ME（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣(yang)總) ÷T = 4823×ΔA÷W

按(an)細菌(jun)或細(xi)胞密度(du)計算(suan)：

單(dan)位(wei)的定義(yi)：每(mei) 1 萬(wan)個細菌(jun)或細(xi)胞每(mei)分(fen)鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol NADH 定義(yi)為(wei)壹(yi)個酶活力單(dan)位(wei)。

NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣(yang)總) ÷T =9.646×ΔA

V 反總：反應(ying)體(ti)系總體積(ji)，9×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色(se)皿(min)光徑，1cm； V 樣：加入樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.03 ml；V 樣總：加入提(ti)取液(ye)體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時間(jian)，1 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)質濃度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g；500：細菌(jun)或細(xi)胞總數，500 萬(wan)。

NAD-蘋果酸酶試(shi)劑(ji)盒(he) 輔酶Ⅱ