ME 廣泛(fan)存(cun)在於微生物、培(pei)養(yang)細(xi)胞、動(dong)物(wu)和(he)植物(wu)胞漿(jiang)中，尤其在植物(wu)組織中(zhong)活性(xing)較(jiao)高。
NADP-蘋(ping)果酸(suan)酶(mei)試劑盒(he) 輔(fu)酶(mei)Ⅱ

NADP-蘋(ping)果酸(suan)酶(mei)（Malic enzyme    ，NADP-ME）試劑盒(he)說明書

分光(guang)光(guang)度(du)法 50 管(guan)/48 樣

NADP-蘋(ping)果酸(suan)酶(mei)試劑盒(he) 輔(fu)酶(mei)Ⅱ

正式測(ce)定前(qian)務必(bi)取 2-3 個預(yu)期差(cha)異(yi)較大的樣(yang)本(ben)做預測(ce)定測(ce)定意義：

ME 廣泛存(cun)在於微生物、培(pei)養(yang)細(xi)胞、動(dong)物(wu)和(he)植物(wu)胞漿(jiang)中，尤其在植物(wu)組織中(zhong)活性(xing)較(jiao)高。ME 催化蘋(ping)果酸(suan)氧化(hua)脫羧(suo)的可(ke)逆(ni)反(fan)應，產(chan)生丙酮酸(suan)和(he)CO2，以及(ji)伴隨NAD(P)+的還(hai)原反(fan)應，是蘋(ping)果酸(suan)代(dai)謝(xie)的關鍵(jian)酶(mei)。 ME 活性(xing)與(yu)生物合成(cheng)和(he)抗氧(yang)化密切(qie)相關。近(jin)年來(lai)植物(wu) ME 活性(xing)測(ce)定較(jiao)多(duo)，已(yi)經(jing)成(cheng)為(wei)抗氧(yang)化研(yan)究(jiu)的熱點(dian)。根(gen)據輔(fu)酶(mei)專壹(yi)性(xing)和(he)對底(di)物特異(yi)性(xing)的不(bu)同(tong)，可將(jiang)ME 分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和(he)NADP-ME(EC1.1.1.40)。

測(ce)定原理：

‍

NADP-ME 催化NADP+還(hai)原成(cheng) NADPH，在 340nm 下(xia)測(ce)定NADPH 增加(jia)速率。

組成(cheng)：

試劑二：粉劑(ji)×1 瓶，-20℃保存(cun)； 臨用(yong)前(qian)加(jia)入 50ml 試劑壹(yi)充分振(zhen)蕩(dang)，溶(rong)解(jie)待(dai)用，用不(bu)完的試劑分(fen)裝(zhuang)後(hou)-20

度(du)保存(cun)，禁止反(fan)復凍融。

試劑三(san)：粉劑(ji)×1 瓶，-20℃保存(cun)；臨用(yong)前(qian)加(jia)入 6ml 蒸餾(liu)水(shui)充分振(zhen)蕩(dang)，溶(rong)解(jie)待(dai)用，用不(bu)完的試劑分(fen)裝(zhuang)後(hou)-20

度(du)保存(cun)，禁止反(fan)復凍融。

自備儀(yi)器和(he)用品：

紫外分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、水(shui)浴鍋(guo)、臺(tai)式離(li)心(xin)機(ji)、可調(tiao)式移(yi)液(ye)器、1 ml 石英比色(se)皿(min)和(he)蒸餾(liu)水(shui)。

樣本的前(qian)處(chu)理：

1、細菌(jun)、細胞或組織樣(yang)品的制(zhi)備：

細菌(jun)或培(pei)養(yang)細(xi)胞：先收集(ji)細(xi)菌(jun)或細胞到(dao)離(li)心(xin)管(guan)內，離(li)心(xin)後(hou)棄上(shang)清；按照(zhao)細(xi)菌(jun)或細胞數(shu)量（104 個(ge)）：提(ti)取液體(ti)積（ml）為(wei) 500~1000：1 的比(bi)例（建議 500 萬(wan)細(xi)菌(jun)或細胞加(jia)入 1ml 提取液），超聲波破(po)碎(sui)細菌(jun)或細胞

（冰(bing)浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重復(fu) 30 次）；14000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清，置冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

組織：按(an)照(zhao)組(zu)織質(zhi)量（g）：提(ti)取液體(ti)積(ml)為(wei) 1：5~10 的比(bi)例（建議稱取約(yue) 0.1g 組(zu)織，加(jia)入 1ml 提取液），進行(xing)冰(bing)浴勻(yun)漿(jiang)。14000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清，置冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

2、血清（漿(jiang)）樣品：直(zhi)接檢測(ce)。

測(ce)定步(bu)驟：

1、分光(guang)光(guang)度(du)計預(yu)熱 30min 以上(shang)，調(tiao)節(jie)波長(chang)至 340nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調(tiao)零。

2、在 1ml 石英比色(se)皿(min)中加(jia)入 50μL 樣本(ben)和(he) 850μL 試劑二，混勻(yun)，30℃孵育(yu) 5min，加(jia)入 100μL 試劑三(san)，混(hun)勻(yun)後(hou)立(li)即記錄(lu) 340nm 處(chu)初(chu)始吸(xi)光(guang)值(zhi)A1 和(he) 1min 後(hou)的吸(xi)光(guang)值(zhi)A2，計算ΔA=A2-A1。

NADP-ME 活性(xing)計算：

按樣本蛋(dan)白濃度(du)計算：

單位的定(ding)義：每(mei)mg 組(zu)織蛋(dan)白每(mei)分(fen)鐘生成(cheng) 1 nmol NADPH 定(ding)義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活力單位。

NADP-ME（nmo/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行(xing)測(ce)定樣(yang)本蛋白質濃度(du)。

按樣本鮮(xian)重(zhong)計算：

單位的定(ding)義：每(mei)g 組(zu)織每(mei)分(fen)鐘生成(cheng) 1 nmol NADPH 定(ding)義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活力單位。

NADP-ME（nmo/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T =3215×ΔA÷W

按細菌(jun)或細胞密度(du)計算：

單位的定(ding)義：每(mei) 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌(jun)或細胞每(mei)分(fen)鐘生成(cheng) 1 nmol NADPH 定(ding)義為壹(yi)個(ge)酶(mei)活力單位。

NADP-ME（nmo/min/104 cell）=[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T =6.43×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反(fan)應體系總(zong)體(ti)積，1×10-3 L；ε：NADPH 摩(mo)爾消(xiao)光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色(se)皿(min)光(guang)徑(jing)， 1cm；V 樣(yang)：加(jia)入樣本(ben)體積，0.1 ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提取液體(ti)積，1 ml；T：反(fan)應時間，1 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋(dan)白質濃度(du)，mg/ml；W：樣本(ben)質量，g；500：細(xi)菌(jun)或細胞總(zong)數(shu)，500 萬(wan)。

NADP-蘋(ping)果酸(suan)酶(mei)試劑盒(he) 輔(fu)酶(mei)Ⅱ