磷(lin)酸(suan)戊(wu)糖(tang)途徑(jing)途徑(jing)中(zhong) 6-磷(lin)酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖(tang)脫氫(qing)酶（G6PDH）和(he) 6PGDH 依次催化NADPH 合(he)成，與(yu)能(neng)量(liang)的平衡(heng)、生長速(su)率(lv)和細胞活(huo)力(li)等密切相(xiang)關(guan)。此外，6PGDH 逆(ni)境(jing)生(sheng)理中具(ju)有(you)重要作(zuo)用(yong)。
6-磷(lin)酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖(tang)酸(suan)脫氫(qing)酶 輔(fu)酶Ⅱ

6-磷(lin)酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖(tang)酸(suan)脫氫(qing)酶（6 - phosphogluconate dehydrogenase， 6-PGDH）說(shuo)明(ming)書

分(fen)光光度(du)法(fa) 50 管/48 樣(yang)

6-磷(lin)酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖(tang)酸(suan)脫氫(qing)酶 輔(fu)酶Ⅱ

正式測(ce)定(ding)前務必取 2-3 個(ge)預(yu)期(qi)差異較(jiao)大(da)的樣本(ben)做預(yu)測(ce)定(ding)測定(ding)意義(yi)：

磷(lin)酸(suan)戊(wu)糖(tang)途徑(jing)途徑(jing)中(zhong) 6-磷(lin)酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖(tang)脫氫(qing)酶（G6PDH）和(he) 6PGDH 依(yi)次(ci)催化NADPH 合(he)成，與(yu)能(neng)量(liang)的平衡(heng)、生長速(su)率(lv)和細胞活(huo)力(li)等密切相(xiang)關(guan)。此外，6PGDH 逆(ni)境(jing)生(sheng)理中具(ju)有(you)重要作(zuo)用(yong)。

測(ce)定(ding)原理：

6PGDH 催(cui)化(hua) 6-磷(lin)酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖(tang)酸(suan)和(he)NADP+生(sheng)成NADPH，NADPH 在(zai) 340 nm 有(you)特(te)征(zheng)吸(xi)收(shou)峰(feng)，而(er)NADP+沒有(you)；通(tong)過測定(ding) 340nm 吸(xi)光(guang)度(du)增(zeng)加(jia)速率，計算(suan) 6PGDH 活(huo)性(xing)。

組(zu)成：

自備儀(yi)器和用(yong)品：

紫外分(fen)光光度(du)計、低(di)溫(wen)離心(xin)機、水(shui)浴鍋(guo)、可(ke)調式(shi)移液槍(qiang)、1ml 石(shi)英(ying)比色皿和(he)蒸餾水。

粗(cu)酶(mei)液提(ti)取(qu)：

1、細菌、細胞或組(zu)織樣(yang)品(pin)的制(zhi)備(bei)：

細菌或培(pei)養(yang)細胞：先(xian)收(shou)集(ji)細菌或細胞到離心(xin)管內，離心(xin)後(hou)棄上清(qing)；按照細菌或細胞數(shu)量(liang)（104 個）：提(ti)取(qu)液體積（ml）為(wei) 1000~5000：1 的比例(li)（建(jian)議(yi) 2000 萬細菌或細胞加入(ru) 1ml 提(ti)取(qu)液），超(chao)聲(sheng)波(bo)破碎(sui)細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲(sheng) 3s，間(jian)隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上清(qing)，置冰上待測。

組(zu)織：按照組(zu)織質量(liang)（g）：提(ti)取(qu)液體積(ml)為(wei) 1：5~10 的比例(li)（建(jian)議(yi)稱(cheng)取(qu)約 0.1g 組(zu)織，加(jia)入(ru) 1ml 提(ti)取(qu)液），進行(xing)冰浴勻漿(jiang)。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上清(qing)，置冰上待測。

2、血(xue)清(qing)（漿(jiang)）樣(yang)品：直接檢(jian)測。

測(ce)定(ding)步驟：

分(fen)光光度(du)計預(yu)熱 30min，調節波長到 340 nm，蒸餾水調(tiao)零(ling)。

將(jiang)試(shi)劑二和(he)試(shi)劑三轉移(yi)至(zhi)試劑(ji)壹(yi)中(zhong)充(chong)分(fen)溶(rong)解；在(zai) 37℃（哺(bu)乳動物(wu)）或 25℃（其它(ta)物(wu)種(zhong)）水浴 10min 以上；用(yong)不完的試劑(ji)分(fen)裝(zhuang)後(hou)-20℃保存(cun)，禁(jin)止(zhi)反(fan)復凍融。

取(qu) 1ml 石(shi)英(ying)比色皿，依(yi)次(ci)加(jia)入(ru) 50μl 樣(yang)本(ben)和 950μl 試劑(ji)壹(yi)，於 340nm 處測定(ding) 3min 內吸(xi)光(guang)值變化，第 10 s

吸(xi)光(guang)值記為(wei)A1，第 190s 吸(xi)光(guang)值記為(wei)A2。△A=A2-A1

註(zhu)意(yi)：空白(bai)管只需(xu)要做(zuo)壹(yi)次(ci)。

6PGDH 活(huo)性(xing)計(ji)算(suan)公式(shi)

1、血(xue)清(qing)（漿(jiang)）6PGDH 活(huo)力(li)的計算(suan):

單位的定(ding)義：每(mei) ml 血清(qing)（漿(jiang)）每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成 1 nmol 的NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

6PGDH（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=1071.8×ΔA

2、組(zu)織、細菌或細胞中 6PGDH 活(huo)力(li)的計算(suan):

按樣本(ben)蛋白(bai)濃(nong)度(du)計算(suan)：

單位的定(ding)義：每(mei)mg 組(zu)織蛋白(bai)每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成 1 nmol NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

6PGDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1071.8×ΔA÷Cpr

按樣本(ben)鮮重計算(suan)：

單位的定(ding)義：每(mei)g 組(zu)織每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成 1 nmol NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

6PGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=1071.8×ΔA÷W

按細菌或細胞密度(du)計(ji)算(suan)：

單位的定(ding)義：每(mei) 1 萬個細菌或細胞每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成 1 nmol NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單位。

6PGDH（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(2000×V 樣÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=0.536×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反(fan)應(ying)體系總(zong)體積，1×10-3 L；ε：NADPH 摩(mo)爾(er)消光(guang)系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色(se)皿(min)光徑(jing)， 1cm；V 樣(yang)：加入樣(yang)本(ben)體積，0.05 ml；V 樣總(zong)：加入(ru)提(ti)取(qu)液體積，1 ml；T：反(fan)應(ying)時(shi)間，3 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白(bai)質濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣本(ben)質量(liang)，g；2000：細菌或細胞總(zong)數(shu)，2000 萬。

6-磷(lin)酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖(tang)酸(suan)脫氫(qing)酶 輔(fu)酶Ⅱ