脯(pu)an酸是(shi)植(zhi)物(wu)體(ti)內適應(ying)逆(ni)境(jing)脅迫的壹種(zhong)重要的(de)滲(shen)透調(tiao)節(jie)物(wu)質。高(gao)等植(zhi)物(wu)中(zhong)脯(pu)an酸代(dai)謝(xie)因(yin)其(qi)初(chu)始底物(wu)不(bu)同(tong)，分為谷an酸( Glu) 和(he)鳥(niao)an酸( Orn) 兩條合(he)成途(tu)徑。
吡(bi)luo啉(lin)-5-羧(suo)酸合(he)成(cheng)酶(mei)P5CS試(shi)劑(ji)盒(he) 氨(an)基(ji)酸

吡(bi)luo啉(lin)-5-羧(suo)酸合(he)成(cheng)酶(mei)（P5CS）試(shi)劑(ji)盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

分光光度法 50 管(guan)/24 樣(yang)

吡(bi)luo啉(lin)-5-羧(suo)酸合(he)成(cheng)酶(mei)P5CS試(shi)劑(ji)盒(he) 氨(an)基(ji)酸

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前務(wu)必(bi)取 2-3 個預期差(cha)異較大的樣(yang)本做(zuo)預測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意(yi)義(yi)：

脯(pu)an酸是(shi)植(zhi)物(wu)體(ti)內適應(ying)逆(ni)境(jing)脅迫的壹種(zhong)重要的(de)滲(shen)透調(tiao)節(jie)物(wu)質。高(gao)等植(zhi)物(wu)中(zhong)脯(pu)an酸代(dai)謝(xie)因(yin)其(qi)初(chu)始底物(wu)不(bu)同，分為谷an酸( Glu) 和(he)鳥(niao)an酸( Orn) 兩條合(he)成途(tu)徑。

吡(bi)luo啉(lin)-5-羧(suo)酸合(he)成(cheng)酶(mei)（P5CS，Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase）是(shi)以谷an酸為前體(ti)合(he)成脯(pu)an酸途(tu)徑的(de)關鍵酶(mei)，對(dui)植(zhi)物(wu)適(shi)應逆(ni)境(jing)脅迫起關鍵作(zuo)用。

測(ce)定(ding)原(yuan)理(li)：

吡(bi)luo啉(lin)-5-羧(suo)酸合(he)成(cheng)酶(mei)催(cui)化(hua)谷an酸生(sheng)成(cheng) P5C 過(guo)程(cheng)中分解(jie)ATP 生(sheng)成(cheng)ADP 和無(wu)機(ji)磷，通過(guo)鉬酸銨(an)比(bi)色法測(ce)定(ding)單位(wei)時間(jian)內(nei)產生(sheng)無(wu)機(ji)磷的量可(ke)確(que)定(ding)P5CS 活性。

組(zu)成：

試劑(ji)四(si)用時加入(ru) 25 ml 蒸餾水(shui)，溶解(jie)後 4℃保存(cun)壹周；試劑(ji)五(wu)用時加入(ru) 25 ml 蒸餾水(shui)，溶解(jie)後 4℃保存(cun)壹周；

0.5μmol/ml 標準(zhun)磷應用液配制：

將(jiang)試(shi)劑(ji)七(qi) 20 倍稀釋，即(ji)取 0.1ml 試劑(ji)七(qi)加 1.9ml 蒸餾水(shui)充分混勻(yun)。

定(ding)磷劑(ji)的(de)配制：

按H2O: 試劑(ji)四(si):試劑(ji)五(wu):試劑(ji)六(liu)=2:1:1:1 的(de)比(bi)例配制，配好的定(ding)磷劑(ji)應(ying)為淺黃色。若無(wu)色則試劑(ji)失(shi)效，若是(shi)藍(lan)色則為磷汙染(ran)，定(ding)磷劑(ji)現(xian)用現配。

註意(yi)：配試劑(ji)最(zui)好用新的燒(shao)杯、玻(bo)棒和(he)玻(bo)璃移(yi)液器(qi)，也可以(yi)用壹次(ci)性塑(su)料器(qi)皿(min)，避(bi)免(mian)磷汙染(ran)。

自備儀(yi)器(qi)和(he)用品(pin)：

可見(jian)外分光光度計、臺(tai)式離(li)心機(ji)、水(shui)浴鍋(guo)、可(ke)調(tiao)式移(yi)液器(qi)、1ml 玻(bo)璃比(bi)色皿(min)、研(yan)缽(bo)、冰和蒸餾水(shui)。

樣(yang)品(pin)酶(mei)液(ye)的制備：

1、組(zu)織樣(yang)品(pin)：按照組(zu)織質量（g）：試(shi)劑(ji)壹(yi)體(ti)積(ml)為 1：5~10 的比(bi)例（建議(yi)稱取約(yue) 0.1g 組(zu)織，加入(ru)

1ml 試劑(ji)壹(yi)），進(jin)行(xing)冰浴勻(yun)漿(jiang)。8000g 4℃離(li)心 10min，取上清(qing)，置(zhi)冰上待測(ce)。

2、血清(qing)（漿）樣(yang)品(pin)：直(zhi)接檢測(ce)。

操作(zuo)步(bu)驟(zhou)：

1、分光光度計或(huo)酶(mei)標(biao)儀預熱(re) 30min 以上，調(tiao)節(jie)波長至(zhi) 660nm。

2、酶(mei)促(cu)反(fan)應（在EP 管(guan)中(zhong)加入(ru)下(xia)列試劑(ji)）

混勻(yun)，37℃（哺乳(ru)動物(wu)）或(huo) 25℃（其(qi)他(ta)物(wu)種(zhong)）準(zhun)確水(shui)浴 10min

混勻(yun)，8000g，25℃離(li)心 10min，取上清(qing)液

3、定(ding)磷（在EP 管(guan)或(huo) 96 孔板(ban)中加入(ru)下(xia)列試劑(ji)）

混勻(yun)，室(shi)溫(wen)放(fang)置(zhi) 30min，在 660nm 處，記錄(lu)各(ge)管(guan)吸(xi)光值。

註意(yi)：

1、由於每(mei)壹個(ge)樣(yang)都必(bi)須做(zuo)對(dui)照，本試(shi)劑(ji)盒(he) 50 管(guan)保證測(ce) 24 份P5CS 活性。

2、此(ci)法具有(you)微(wei)量、靈(ling)敏(min)、快(kuai)速的(de)特(te)點。所以對(dui)測(ce)定(ding)所用試管(guan)要(yao)求嚴(yan)格無(wu)磷。

3、空白(bai)管(guan)和(he)標準(zhun)管(guan)只(zhi)要(yao)做(zuo)壹(yi)管(guan)。每(mei)個測(ce)定(ding)管(guan)設(she)壹個對(dui)照管(guan)。

計算

1、血清(qing)（漿）P5CS 活力的(de)計算:

單位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)小時每(mei)毫升血清(qing)（漿）中P5CS 消耗(hao)ATP 產生(sheng) 1μmol 無(wu)機(ji)磷的量為壹個(ge)酶(mei)活力單(dan)位(wei)。

P5CS 活力（μmol/h/ml）=C 標(biao)準(zhun)管(guan)×（A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan)）÷（A 標(biao)準(zhun)管(guan)-A 空白(bai)管(guan)）×V 總(zong)÷V 樣(yang)÷T=9

×（A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan)）÷（A 標(biao)準(zhun)管(guan)-A 空白(bai)管(guan)）

2、組(zu)織中(zhong)P5CS 活力的(de)計算：

按蛋(dan)白(bai)濃度(du)計算：

單位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)小時每(mei)毫克組(zu)織蛋(dan)白(bai)中 P5CS 消耗(hao)ATP 產生(sheng) 1μmol 無(wu)機(ji)磷的量為壹個(ge)酶(mei)活力單(dan)位(wei)。

P5CS 活力(μmol/h /mg prot)=C 標準(zhun)管(guan)×（A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan)）÷（A 標(biao)準(zhun)管(guan)-A 空白(bai)管(guan)）×V 總(zong)÷（Cpr×V樣(yang)）÷T =9 ×（A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan)）÷（A 標(biao)準(zhun)管(guan)-A 空白(bai)管(guan)）÷Cpr

按樣(yang)本鮮重(zhong)計(ji)算：

單位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)小時每(mei)克組(zu)織中(zhong) P5CS 消耗(hao)ATP 產生(sheng) 1μmol 無(wu)機(ji)磷的量為壹個(ge)酶(mei)活力單(dan)位(wei)。

P5CS 活力(μmol/h /g 鮮重(zhong))=C 標(biao)準(zhun)管(guan)×（A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan)）÷（A 標(biao)準(zhun)管(guan)-A 空白(bai)管(guan)）×V 總(zong)÷(W× V

樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T=9 ×（A 測(ce)定(ding)管(guan)-A 對(dui)照管(guan)）÷（A 標(biao)準(zhun)管(guan)-A 空白(bai)管(guan)）÷W

C 標準(zhun)管(guan)：標(biao)準(zhun)管(guan)濃(nong)度，0.5μmol/ml；V 總：酶(mei)促(cu)反(fan)應總(zong)體積，0.3ml；V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本體(ti)積，0.1ml ； V 樣(yang)總：加入(ru)提(ti)取液體積，1ml；T：反(fan)應時(shi)間，1/6 小時；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白(bai)質濃度，mg/ml；W：樣(yang)本鮮重(zhong)， g。

吡(bi)luo啉(lin)-5-羧(suo)酸合(he)成(cheng)酶(mei)P5CS試(shi)劑(ji)盒(he) 氨(an)基(ji)酸