α-GC(EC 3.2.1.20)廣(guang)泛(fan)存在於(yu)動(dong)物(wu)、植(zhi)物(wu)、微(wei)生(sheng)物(wu)和培養細胞中(zhong)，催(cui)化(hua)水(shui)解(jie)芳基(ji)或烴(ting)基(ji)與(yu)糖基(ji)之(zhi)間的(de)α-糖苷(gan)鍵(jian)生(sheng)成葡(pu)萄糖，不僅與(yu)細胞(bao)壁(bi)的(de)松弛或加(jia)固有(you)關(guan)，而且(qie)與(yu)細胞(bao)識(shi)別(bie)和壹(yi)些信號分(fen)子(zi)產生(sheng)密(mi)切相關。
α-葡(pu)萄糖苷(gan)酶(mei)試劑(ji)盒 糖代(dai)謝

α-葡(pu)萄糖苷(gan)酶(mei)（α-Glucosidase, α-GC）試(shi)劑盒說(shuo)明(ming)書

微(wei)量法(fa) 100 管/48 樣(yang)

α-葡(pu)萄糖苷(gan)酶(mei)試劑(ji)盒 糖代(dai)謝

正(zheng)式測(ce)定前(qian)務必(bi)取(qu) 2-3 個(ge)預(yu)期差(cha)異較大的(de)樣(yang)本做(zuo)預(yu)測(ce)定測(ce)定意(yi)義(yi)：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣(guang)泛(fan)存在於(yu)動(dong)物(wu)、植(zhi)物(wu)、微(wei)生(sheng)物(wu)和培養細胞中(zhong)，催(cui)化(hua)水(shui)解(jie)芳基(ji)或烴(ting)基(ji)與(yu)糖基(ji)之(zhi)間的(de)α-糖苷(gan)鍵(jian)生(sheng)成葡(pu)萄糖，不僅與(yu)細胞(bao)壁(bi)的(de)松弛或加(jia)固有(you)關(guan)，而且(qie)與(yu)細胞(bao)識(shi)別(bie)和壹(yi)些信號分(fen)子(zi)產生(sheng)密(mi)切相關。

測(ce)定原(yuan)理(li)：

α-GC 分(fen)解(jie)對-硝基(ji)苯-α-D 吡喃葡(pu)萄糖苷(gan)生(sheng)成對-硝基(ji)苯fen，後(hou)者(zhe)在 400nm 有(you)最(zui)大吸(xi)收峰(feng)，通(tong)過測(ce)定吸(xi)光(guang)值升高(gao)速(su)率來(lai)計(ji)算α-GC 活(huo)性。

組(zu)成：

試(shi)劑壹(yi)：粉劑(ji)×1 瓶(ping)，-20℃保(bao)存；臨(lin)用(yong)前(qian)加(jia)入 12ml 蒸餾(liu)水，充(chong)分(fen)溶(rong)解備用(yong)；用(yong)不完(wan)的(de)試(shi)劑(ji)仍(reng)-20℃保(bao)存。

自(zi)備(bei)儀(yi)器和用(yong)品：

可(ke)見分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)/酶標(biao)儀、臺(tai)式離(li)心機(ji)、水浴(yu)鍋(guo)、可調式移液(ye)器、微(wei)量石英(ying)比(bi)色皿(min)/96 孔(kong)板、研(yan)缽、冰和蒸餾(liu)水。

粗(cu)酶液(ye)提(ti)取(qu)：

1、細(xi)菌或培(pei)養細胞：先收集(ji)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)到離(li)心管內，離心後(hou)棄(qi)上清(qing)；按(an)照細菌或細(xi)胞(bao)數(shu)量（104 個(ge)）：提(ti)取(qu)液(ye)體積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比(bi)例(li)（建議 500 萬細菌或細(xi)胞(bao)加(jia)入 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)），超(chao)聲波(bo)破碎(sui)細菌或細(xi)胞(bao)（冰浴(yu)，功率(lv) 20％或 200W，超(chao)聲 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重(zhong)復 30 次(ci)）；15000g 4℃離心 10min，取(qu)上(shang)清(qing)，置(zhi)冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

2、組(zu)織：按照組(zu)織質(zhi)量(liang)（g）：提(ti)取(qu)液(ye)體積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的(de)比(bi)例(li)（建議稱取(qu)約(yue) 0.1g 組(zu)織，加(jia)入 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)），進(jin)行(xing)冰(bing)浴(yu)勻漿(jiang)。15000g 4℃離(li)心 10min，取(qu)上(shang)清(qing)，置(zhi)冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

測(ce)定步(bu)驟(zhou)：

1、分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)或酶(mei)標(biao)儀預(yu)熱 30min 以(yi)上，調節波長至(zhi) 400nm，蒸(zheng)餾水調(tiao)零。

2、加(jia)樣(yang)表

充(chong)分(fen)混(hun)勻，放入 37℃準確(que)水(shui)浴(yu) 30min 後(hou)，立(li)即(ji)放入 95℃水浴(yu) 5min（蓋(gai)緊(jin)，以防止(zhi)水分(fen)散失），流(liu)水冷(leng)卻(que)後(hou)充(chong)分(fen)混(hun)勻（以(yi)保(bao)證濃度不變(bian)），8000g，4℃，離心 5min，取(qu)上(shang)清(qing)液(ye)（在 EP 管或 96 孔(kong)板中(zhong)加(jia)入下列試劑(ji)）

充(chong)分(fen)混(hun)勻，室溫(wen)靜(jing)置(zhi) 2min 後(hou)， 400nm 處(chu)測(ce)定吸(xi)光(guang)值A，計(ji)算ΔA=A 測(ce)定管-A 對照管。每個測(ce)定管需設壹(yi)個對照管。

α-GC 活(huo)力計(ji)算：

用(yong)微(wei)量石英(ying)比(bi)色皿(min)測(ce)定的(de)計(ji)算公(gong)式如(ru)下

標(biao)準條件下測(ce)定的(de)回(hui)歸(gui)方(fang)程為(wei)y = 0.00585x -0.0027；x 為(wei)標(biao)準品濃度（nmol/ml），y 為(wei)吸(xi)光(guang)值。

按(an)樣(yang)本蛋(dan)白濃(nong)度計(ji)算：

單(dan)位的(de)定(ding)義(yi)：每mg 組(zu)織蛋(dan)白每分(fen)鐘產生(sheng) 1nmol 對-硝基(ji)苯fen定義(yi)為(wei)壹(yi)個酶活(huo)性單(dan)位。

α-GC 活(huo)性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(V 樣(yang)×Cpr)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮(xian)重(zhong)計(ji)算：

單(dan)位的(de)定(ding)義(yi)：每g 組(zu)織每分(fen)鐘產生(sheng) 1nmol 對-硝基(ji)苯fen定義(yi)為(wei)壹(yi)個酶活(huo)性單(dan)位。

α-GC 活(huo)性(nmol/min/g 鮮(xian)重(zhong))=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(W×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T

=56.98×(ΔA+0.0027) ÷W

按(an)細菌或細(xi)胞(bao)密度計(ji)算：

單(dan)位的(de)定(ding)義(yi)：每 1 萬個(ge)細菌或細(xi)胞(bao)每分(fen)鐘產生(sheng) 1nmol 對-硝基(ji)苯fen定義(yi)為(wei)壹(yi)個酶活(huo)性單(dan)位。

α-GC 活(huo)性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T

=0.114×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應體系總體積(ji)，0.3ml；V 樣(yang)：加(jia)入反應體系中(zhong)樣(yang)本體積(ji)，0.03ml；V 樣(yang)總：加(jia)入提(ti)取(qu)液(ye)體積(ji)， 1ml；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白質(zhi)濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g； 500：細胞或細(xi)菌總(zong)數(shu)，500 萬；T：反應時間， 30min。

用(yong) 96 孔(kong)板測(ce)定的(de)計(ji)算公(gong)式如(ru)下

標(biao)準條件下測(ce)定的(de)回(hui)歸(gui)方(fang)程為(wei)y = 0.0039x -0.0027；x 為(wei)標(biao)準品濃度（nmol/ml），y 為(wei)吸(xi)光(guang)值。

按(an)樣(yang)本蛋(dan)白濃(nong)度計(ji)算：

單(dan)位的(de)定(ding)義(yi)：每mg 組(zu)織蛋(dan)白每分(fen)鐘產生(sheng) 1nmol 對-硝基(ji)苯fen定義(yi)為(wei)壹(yi)個酶活(huo)性單(dan)位。

α-GC 活(huo)性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(V 樣(yang)×Cpr)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮(xian)重(zhong)計(ji)算：

單(dan)位的(de)定(ding)義(yi)：每g 組(zu)織每分(fen)鐘產生(sheng) 1nmol 對-硝基(ji)苯fen定義(yi)為(wei)壹(yi)個酶活(huo)性單(dan)位。

α-GC 活(huo)性(nmol/min/g 鮮(xian)重(zhong))=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反總]÷(W×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T

=85.47×(ΔA+0.0027) ÷W

按(an)細菌或細(xi)胞(bao)密度計(ji)算：

單(dan)位的(de)定(ding)義(yi)：每 1 萬個(ge)細菌或細(xi)胞(bao)每分(fen)鐘產生(sheng) 1nmol 對-硝基(ji)苯fen定義(yi)為(wei)壹(yi)個酶活(huo)性單(dan)位。

α-GC 活(huo)性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反總]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T

=0.171×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應體系總體積(ji)，0.3ml；V 樣(yang)：加(jia)入反應體系中(zhong)樣(yang)本體積(ji)，0.03ml；V 樣(yang)總：加(jia)入提(ti)取(qu)液(ye)體積(ji)， 1ml；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白質(zhi)濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g； 500：細胞或細(xi)菌總(zong)數(shu)，500 萬；T：反應時間， 30min。

α-葡(pu)萄糖苷(gan)酶(mei)試劑(ji)盒 糖代(dai)謝