濾紙(zhi)酶水(shui)解(jie)濾紙(zhi)產生的還(hai)原糖(tang)能與(yu) 3,5-二(er)硝基水(shui)楊(yang)酸(suan)生成紅棕(zong)色氨基化(hua)合(he)物(wu)，在(zai) 540nm 處有最大光(guang)吸收，在(zai)壹(yi)定(ding)範(fan)圍內反應(ying)液顏(yan)色深(shen)淺(qian)與(yu)還(hai)原糖(tang)的量成正比(bi)，可測(ce)定(ding)計(ji)算(suan)得(de)濾紙(zhi)酶的活(huo)力(li)。
濾紙(zhi)酶試劑(ji)盒 糖代謝

濾紙(zhi)酶（Filter paper Activity，FPA）試劑(ji)盒說(shuo)明(ming)書

微量法(fa) 100 管/48 樣(yang)

濾紙(zhi)酶試劑(ji)盒 糖代謝

正(zheng)式(shi)測定(ding)前(qian)務(wu)必(bi)取 2-3 個預期差(cha)異較(jiao)大(da)的樣(yang)本(ben)做(zuo)預測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意義：

纖(xian)維(wei)素酶是由(you)微生(sheng)物(wu)產生的多(duo)組分的酶系，能(neng)水(shui)解(jie)纖(xian)維(wei)素β-1,4 葡(pu)萄(tao)糖苷(gan)鍵(jian)生(sheng)成葡(pu)萄(tao)糖，研究濾紙(zhi)酶活(huo)力(li)對(dui)纖(xian)維(wei)素酶的研究具有非(fei)常重(zhong)要的意義。

測(ce)定(ding)原(yuan)理(li)：

濾紙(zhi)酶水(shui)解(jie)濾紙(zhi)產生的還(hai)原糖(tang)能與(yu) 3,5-二(er)硝基水(shui)楊(yang)酸(suan)生成紅棕(zong)色氨基化(hua)合(he)物(wu)，在(zai) 540nm 處有最大光(guang)吸收，在(zai)壹(yi)定(ding)範(fan)圍內反應(ying)液顏(yan)色深(shen)淺(qian)與(yu)還(hai)原糖(tang)的量成正比(bi)，可測(ce)定(ding)計(ji)算(suan)得(de)濾紙(zhi)酶的活(huo)力(li)。

組成：

自備儀器(qi)和(he)用(yong)品(pin)：

天(tian)平(ping)、研缽、低溫(wen)離(li)心(xin)機(ji)、可見分光(guang)光(guang)度計/酶標儀(yi)、微量石(shi)英比色皿/96 孔板(ban)、恒溫(wen)水(shui)浴(yu)鍋。

酶液提(ti)取：

組織(zhi)：按(an)照(zhao)質量（g）：蒸餾(liu)水(shui)體積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的比例(li)（建議(yi)稱取約 0.1g，加入(ru) 1ml 蒸餾(liu)水(shui)）加入(ru)蒸餾(liu)水(shui)，冰浴(yu)勻漿後(hou)於(yu) 4℃，12000rpm 離心 10min，取上清(qing)置(zhi)於(yu)冰上待測(ce)。

細(xi)胞(bao)：按(an)照(zhao)細胞(bao)數量（104 個）：蒸餾(liu)水(shui)體積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的比例(li)（建議(yi) 500 萬(wan)細(xi)胞加入(ru) 1ml提取液），冰浴(yu)超聲(sheng)波(bo)破(po)碎(sui)細(xi)胞（功率 300w，超(chao)聲(sheng) 3 秒，間隔(ge) 7 秒，總(zong)時(shi)間 3min）；然後(hou) 4℃，12000rpm離心(xin) 10min，取上清(qing)置(zhi)於(yu)冰上待測(ce)。

培養(yang)液或其(qi)它(ta)液體：直接(jie)檢(jian)測(ce)。

測(ce)定(ding)操(cao)作：

根(gen)據(ju)樣(yang)本(ben)數(shu)量取兩倍(bei)數(shu)量的濾紙(zhi)條(tiao)和(he) Ep 管，每支Ep 管中(zhong)放入壹(yi)個(ge)卷(juan)狀(zhuang)濾紙(zhi)條(tiao)（註意要放入底(di)部(bu)），作為(wei)底(di)物。

對(dui)照(zhao)管：取 200μl 滅活(huo)的酶液，加入(ru) 500μl 試劑(ji)壹(yi)，充(chong)分混(hun)勻(yun)，再加入(ru)放有濾紙(zhi)條(tiao)的 Ep 管中(zhong)，標(biao)註(zhu)為(wei)對(dui)照(zhao)管。

測(ce)定(ding)管：取 200μl 酶液，加入(ru) 500μl 試劑(ji)壹(yi)，充(chong)分混(hun)勻(yun)，再加入(ru)放有濾紙(zhi)條(tiao)的 Ep 管中(zhong)，標(biao)註(zhu)為(wei)測定(ding)管。

對(dui)照(zhao)管和(he)測定(ding)管同(tong)時(shi)置(zhi)於(yu) 50℃水(shui)浴(yu)鍋中(zhong)反應(ying) 30min。

加入(ru) 800μl 試劑(ji)二(er)，沸(fei)水(shui)浴(yu) 5min，自來水(shui)冷(leng)卻(que)後(hou)取 200μl 於(yu)微量石(shi)英比色皿/96 孔板(ban)中(zhong)測定(ding) 540nm 處吸光值，分別(bie)記(ji)為(wei)A 對(dui)照(zhao)管和(he)A 測定(ding)管，△A= A 測(ce)定(ding)管- A 對(dui)照(zhao)管。

酶活(huo)性計算(suan)公(gong)式(shi)：

用(yong)微量石(shi)英比色皿測(ce)定(ding)的計算(suan)公(gong)式(shi)如(ru)下標(biao)準(zhun)曲線(xian)：y = 0.2805x - 0.0255，R2 = 0.9991

按(an)照(zhao)蛋白濃(nong)度計(ji)算(suan)

酶活(huo)性定(ding)義(yi)：在 50℃，pH4.6 條(tiao)件(jian)下(xia)，每毫(hao)克蛋白每分鐘分解(jie)濾紙(zhi)產生 1mg 葡(pu)萄(tao)糖所需的酶量為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力(li)單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總(zong)÷（V 樣(yang)×Cpr）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ Cpr

按(an)照(zhao)樣(yang)本(ben)質(zhi)量計算(suan)

酶活(huo)性定(ding)義(yi)：在 50℃，pH4.6 條(tiao)件(jian)下(xia)，每克組織(zhi)每分鐘分解(jie)濾紙(zhi)產生 1mg 葡(pu)萄(tao)糖所需的酶量為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力(li)單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總(zong)÷（W×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ W

按(an)液體體積(ji)計(ji)算(suan)

酶活(huo)性定(ding)義(yi)：在 50℃，pH4.6 條(tiao)件(jian)下(xia)，每毫(hao)升培養(yang)液每分鐘分解(jie)濾紙(zhi)產生 1mg 葡(pu)萄(tao)糖所需的酶量為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力(li)單位。

FPA（U/ml）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總(zong)÷V 樣(yang)÷T

= 0.891×（△A+0.0255）

按(an)細(xi)胞(bao)數(shu)量計算(suan)

酶活(huo)性定(ding)義(yi)：在 50℃，pH4.6 條(tiao)件(jian)下(xia)，每 104 個細胞每分鐘分解(jie)濾紙(zhi)產生 1mg 葡(pu)萄(tao)糖所需的酶量為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力(li)單位。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反總(zong)÷（V 樣(yang)×細(xi)胞數(shu)量（萬個）÷V 樣(yang)總(zong)）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ 細(xi)胞(bao)數量（萬個）

V 反總(zong)：反應(ying)總(zong)體積(ji)，1.5ml，V 樣(yang)：反應(ying)體系(xi)中(zhong)加入(ru)樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.2ml；V 樣(yang)總(zong)：加入(ru)提取液體積(ji)，1ml；

Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本(ben)質(zhi)量，g；T：反應(ying)時(shi)間，30min

用(yong) 96 孔板(ban)測(ce)定(ding)的計算(suan)公(gong)式(shi)如(ru)下

標(biao)準(zhun)曲線(xian)：y = 0.1403x - 0.0255，R2 = 0.9991

按(an)照(zhao)蛋白濃(nong)度計(ji)算(suan)

酶活(huo)性定(ding)義(yi)：在 50℃，pH4.6 條(tiao)件(jian)下(xia)，每毫(hao)克蛋白每分鐘分解(jie)濾紙(zhi)產生 1mg 葡(pu)萄(tao)糖所需的酶量為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力(li)單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反總(zong)÷（V 樣(yang)×Cpr）÷T

=1.782×（△A+0.0255）÷ Cpr

按(an)照(zhao)樣(yang)本(ben)質(zhi)量計算(suan)

酶活(huo)性定(ding)義(yi)：在 50℃，pH4.6 條(tiao)件(jian)下(xia)，每克組織(zhi)每分鐘分解(jie)濾紙(zhi)產生 1mg 葡(pu)萄(tao)糖所需的酶量為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力(li)單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反總(zong)÷（W×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)）÷T

= 1.782×（△A+0.0255）÷ W

按(an)液體體積(ji)計(ji)算(suan)

酶活(huo)性定(ding)義(yi)：在 50℃，pH4.6 條(tiao)件(jian)下(xia)，每毫(hao)升培養(yang)液每分鐘分解(jie)濾紙(zhi)產生 1mg 葡(pu)萄(tao)糖所需的酶量為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力(li)單位。

FPA（U/ml）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反總(zong)÷V 樣(yang)÷T

= 1.782×（△A+0.0255）

按(an)細(xi)胞(bao)數(shu)量計算(suan)

酶活(huo)性定(ding)義(yi)：在 50℃，pH4.6 條(tiao)件(jian)下(xia)，每 104 個細胞每分鐘分解(jie)濾紙(zhi)產生 1mg 葡(pu)萄(tao)糖所需的酶量為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力(li)單位。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V 反總(zong)÷（V 樣(yang)×細(xi)胞數(shu)量（萬個）÷V 樣(yang)總(zong)）÷T

= 1.782×（△A+0.0255）÷ 細(xi)胞(bao)數量（萬個）

V 反總(zong)：反應(ying)總(zong)體積(ji)，1.5ml，V 樣(yang)：反應(ying)體系(xi)中(zhong)加入(ru)樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.2ml；V 樣(yang)總(zong)：加入(ru)提取液體積(ji)，1ml；

Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本(ben)質(zhi)量，g；T：反應(ying)時(shi)間，30min

註(zhu)意事項：

用(yong)幹(gan)凈的鑷子(zi)取出(chu)濾紙(zhi)條(tiao)，帶手套(tao)卷(juan)成卷放入Ep 管底(di)部(bu)。

樣(yang)本(ben)滅活(huo)時(shi)保(bao)證(zheng)同(tong)壹(yi)批(pi)樣(yang)本(ben)處理(li)時(shi)間壹(yi)致(zhi)，建議(yi)沸(fei)水(shui)浴(yu)十分鐘。

批(pi)量樣(yang)本(ben)測(ce)定(ding)之(zhi)前(qian)先做(zuo) 1-2 個(ge)樣(yang)本(ben)的預實(shi)驗(yan)，若(ruo)吸光值超過(guo) 1.2，建議(yi)將(jiang)樣(yang)本(ben)用(yong)蒸餾(liu)水(shui)稀(xi)釋後(hou)再進(jin)行測定(ding)，計(ji)算(suan)公(gong)式(shi)中(zhong)乘(cheng)以稀(xi)釋倍數。

顯(xian)色後(hou)取檢測(ce)液時(shi)註(zhu)意槍頭不(bu)要碰(peng)到濾紙(zhi)條(tiao)，以免(mian)帶入毛(mao)狀(zhuang)物，影響(xiang)測定(ding)結(jie)果

濾紙(zhi)酶試劑(ji)盒 糖代謝