α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣(guang)泛存在於(yu)動物(wu)、植(zhi)物(wu)微生(sheng)物(wu)和培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)的線粒(li)體(ti)中，是三羧酸(suan)循環(huan)調(tiao)控關(guan)鍵(jian)酶(mei)之(zhi)壹(yi)，催(cui)化(hua)α-酮(tong)shu二(er)酸(suan)氧化脫(tuo)羧生成琥(hu)珀酰輔(fu)mei A。
α-酮(tong)shu二(er)酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei)活(huo)性(xing)測定(ding)試劑盒 三羧酸(suan)

α-酮(tong)shu二(er)酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei)（α-KGDH）活(huo)性(xing)測定(ding)試劑盒說明書(shu)

微量(liang)法(fa) 100 管/96 樣(yang)

α-酮(tong)shu二(er)酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei)活(huo)性(xing)測定(ding)試劑盒 三羧酸(suan)

正式(shi)測(ce)定(ding)前務必取(qu) 2-3 個(ge)預(yu)期差(cha)異(yi)較(jiao)大(da)的樣(yang)本做(zuo)預測(ce)定(ding)

測定意(yi)義：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣(guang)泛存在於(yu)動物(wu)、植(zhi)物(wu)微生(sheng)物(wu)和培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)的線粒(li)體(ti)中，是三羧酸(suan)循環(huan)調(tiao)控關(guan)鍵(jian)酶(mei)之(zhi)壹(yi)，催(cui)化(hua)α-酮(tong)shu二(er)酸(suan)氧化脫(tuo)羧生成琥(hu)珀酰輔(fu)mei A。

測定原(yuan)理(li)：

α-KGDH 催化α-酮(tong)shu二(er)酸(suan)、NAD⁺ 和輔(fu)meiA 生成琥(hu)珀酰輔(fu)meiA、二(er)氧化碳和 NADH，NADH 在 340 nm有特(te)征吸收峰，以NADH 的生成速率(lv)表示α-KGDH 活(huo)性(xing)。

組成：

自備儀器(qi)和用品(pin)：

紫外分(fen)光光度(du)計(ji)/酶(mei)標儀、水(shui)浴鍋、臺(tai)式(shi)離(li)心(xin)機、可調式(shi)移(yi)液器(qi)、微(wei)量(liang)石(shi)英(ying)比(bi)色皿/96 孔板(ban)、研(yan)缽(bo)、冰(bing)和蒸餾水(shui)。

樣(yang)本的前處理(li)：

組織、細菌(jun)或(huo)細胞(bao)中(zhong)胞(bao)漿蛋(dan)白(bai)與線粒(li)體(ti)蛋白(bai)的分離(li)：

1、 稱取(qu)約 0.1g 組(zu)織或(huo)收集(ji) 500 萬(wan)細(xi)胞(bao)，加(jia)入(ru) 1ml 試劑(ji)壹和 10μl 試劑(ji)三，用(yong)冰(bing)浴勻漿器(qi)或(huo)研缽(bo)勻漿。

2、 將勻漿 600g，4℃離(li)心 5min。

3、 棄沈澱，將上清(qing)液移(yi)至(zhi)另壹離(li)心(xin)管中，11000g，4℃離(li)心(xin) 10min。

4、 上清(qing)液即胞(bao)漿提(ti)取(qu)物(wu)，可用(yong)於(yu)測(ce)定(ding)從線(xian)粒(li)體(ti)泄(xie)漏(lou)的α-KGDH（此步(bu)可(ke)選做(zuo)）。

5、 在步驟(zhou)④的沈澱中加入(ru) 200μl 試劑(ji)二(er)和 2μl 試劑(ji)三，超聲(sheng)波破(po)碎（冰(bing)浴，功率(lv) 20％或(huo) 200W，超聲(sheng) 3 秒，間隔 10 秒，重(zhong)復 30 次），用於(yu)線(xian)粒(li)體(ti)α-KGDH 活(huo)性(xing)測定(ding)。

測定步(bu)驟：

1、分光光度(du)計(ji)或(huo)酶(mei)標儀預(yu)熱 30min 以上，調節(jie)波長至(zhi) 340nm，蒸(zheng)餾水(shui)調零(ling)。

2、樣(yang)本測(ce)定(ding)

在試劑(ji)五中加入(ru) 18ml 試劑(ji)四充(chong)分溶解(jie)，置(zhi)於(yu) 37℃（哺乳動物(wu)）或(huo) 25℃（其(qi)它(ta)物(wu)種(zhong)）水浴 10min；現(xian)配現(xian)用；

在試劑(ji)六中(zhong)加入(ru) 1ml 蒸餾水(shui)，充(chong)分溶解(jie)待(dai)用(yong)；用不(bu)完的試劑(ji)分(fen)裝(zhuang)後-20℃保(bao)存(cun)，禁止反復(fu)凍(dong)融；

在微量(liang)石(shi)英(ying)比(bi)色皿或(huo) 96 孔板(ban)中(zhong)加(jia)入(ru) 10μl 樣(yang)本、10μl 試(shi)劑(ji)六和 180μl 試劑(ji)五，混勻，立(li)即記(ji)錄(lu) 340nm

處 20s 時(shi)的吸光值(zhi)A1 和 2min20s 後的吸光值(zhi)A2，計(ji)算(suan)ΔA=A2-A1。

α-KGDH 活(huo)性(xing)計(ji)算(suan)：

按(an)樣(yang)本蛋(dan)白(bai)濃度(du)計(ji)算(suan)

單(dan)位的定義：每mg 組織蛋白(bai)每分(fen)鐘生(sheng)成 1 nmol 的NADH 定義為壹個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

α-KGDH 活(huo)性(xing)（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮重(zhong)計(ji)算(suan)：

單(dan)位的定義：每g 組織每分鐘(zhong)生成 1 nmol 的NADH 定義為壹個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

α-KGDH（nmol/min /g 鮮重(zhong)）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=325×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)密(mi)度計(ji)算(suan)：

單(dan)位的定義：每 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)每(mei)分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為壹個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位。

α-KGDH 活(huo)性(xing)（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=0.65×ΔA

V 反總：反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)總體(ti)積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消光系(xi)數，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色皿光徑(jing)，1cm； V 樣(yang)：加(jia)入(ru)樣(yang)本體(ti)積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加入(ru)提(ti)取(qu)液體(ti)積(ji)，0.202 ml；T：反應(ying)時間(jian)，2min；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白(bai)質濃度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本質量(liang)，g；500：細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)總(zong)數，500 萬(wan)。

b.用 96 孔板(ban)測(ce)定(ding)的計(ji)算(suan)公(gong)式(shi)如(ru)下(xia)

按(an)樣(yang)本蛋(dan)白(bai)濃度(du)計(ji)算(suan)：

單(dan)位的定義：每mg 組織蛋白(bai)每分(fen)鐘生(sheng)成 1 nmol 的NADH 定義為壹個(ge)酶(mei)活(huo)性(xing)單(dan)位。

α-KGDH 活(huo)性(xing)（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮重(zhong)計(ji)算(suan)：

單(dan)位的定義：每g 組織每分鐘(zhong)生成 1 nmol 的NADH 定義為壹個(ge)酶(mei)活(huo)性(xing)單(dan)位。

α-KGDH 活(huo)性(xing)（nmol/min/g 鮮重(zhong)）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=650×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)密(mi)度計(ji)算(suan)：

單(dan)位的定義：每 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)每(mei)分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為壹個(ge)酶(mei)活(huo)性(xing)單(dan)位。

α-KGDH 活(huo)性(xing)（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=1.3×ΔA

V 反總：反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)總體(ti)積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消光系(xi)數，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板(ban)光徑(jing)，0.5cm； V 樣(yang)：加(jia)入(ru)樣(yang)本體(ti)積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加入(ru)提(ti)取(qu)液體(ti)積(ji)，0.202 ml；T：反應(ying)時間(jian)，2min；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白(bai)質濃度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本質量(liang)，g；500：細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)總(zong)數，500 萬(wan)。

α-酮(tong)shu二(er)酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei)活(huo)性(xing)測定(ding)試劑盒 三羧酸(suan)