ICDHm（EC 1.1.1.41）廣泛(fan)存在於(yu)動物(wu)、植物、微(wei)生(sheng)物和(he)培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)的線(xian)粒體中，在(zai)三羧酸循(xun)中催(cui)化(hua)異檸(ning)檬(meng)酸生(sheng)成α-酮戊二酸(suan)，同時將 NAD+ 還(hai)原為(wei)NADH，是(shi)三羧酸循(xun)環(huan)的限(xian)速(su)酶(mei)之壹，其催化(hua)的反(fan)應(ying)是(shi)細(xi)胞(bao) NADH 主(zhu)要(yao)來(lai)源之壹。
線粒體異檸(ning)檬(meng)酸脫(tuo)氫酶(mei)試劑(ji)盒(he) 三羧酸

線(xian)粒體異檸(ning)檬(meng)酸脫(tuo)氫酶(mei)（ICDHm）試劑(ji)盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

微(wei)量法(fa) 100 管/96 樣(yang)

線(xian)粒體異檸(ning)檬(meng)酸脫(tuo)氫酶(mei)試劑(ji)盒(he) 三羧酸

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前務必(bi)取(qu) 2-3 個(ge)預(yu)期(qi)差(cha)異較大的樣(yang)本做預(yu)測定(ding)測(ce)定(ding)意義(yi)：

ICDHm（EC 1.1.1.41）廣泛(fan)存在於(yu)動物(wu)、植物、微(wei)生(sheng)物和(he)培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)的線(xian)粒體中，在(zai)三羧酸循(xun)中催(cui)化(hua)異檸(ning)檬(meng)酸生(sheng)成α-酮戊二酸(suan)，同時將 NAD⁺ 還(hai)原為(wei)NADH，是(shi)三羧酸循(xun)環(huan)的限(xian)速(su)酶(mei)之壹，其催化(hua)的反(fan)應(ying)是(shi)細(xi)胞(bao) NADH 主(zhu)要(yao)來(lai)源之壹。

測(ce)定(ding)原(yuan)理(li)：

ICDHm 催(cui)化(hua)NAD⁺ 還(hai)原生(sheng)成NADH，導致 340nm 處(chu)光吸(xi)收(shou)上(shang)升。

組(zu)成：

自備(bei)儀(yi)器(qi)和用(yong)品：

紫(zi)外分光(guang)光度計(ji)/酶(mei)標(biao)儀(yi)、水浴鍋、臺式(shi)離(li)心(xin)機(ji)、可(ke)調式(shi)移(yi)液(ye)器(qi)、微(wei)量石英比(bi)色(se)皿/96 孔(kong)板、研缽、冰(bing)和蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

樣(yang)本的前處理(li)：

組(zu)織、細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)中胞(bao)漿蛋(dan)白與線(xian)粒體蛋(dan)白的分離(li)：

1、 稱(cheng)取(qu)約(yue) 0.1g 組(zu)織或(huo)收集 500 萬細(xi)胞(bao)，加(jia)入 1ml 試劑(ji)壹和(he) 10μl 試劑(ji)三，用(yong)冰(bing)浴勻(yun)漿(jiang)器(qi)或(huo)研缽勻(yun)漿(jiang)。

2、 將(jiang)勻(yun)漿(jiang) 600g，4℃離(li)心(xin) 5min。

3、 棄(qi)沈澱，將上(shang)清(qing)液(ye)移(yi)至(zhi)另(ling)壹離(li)心(xin)管中，11000g，4℃離(li)心(xin) 10min。

4、 上(shang)清(qing)液(ye)即(ji)胞(bao)漿提取(qu)物(wu)，可用(yong)於(yu)測(ce)定(ding)從(cong)線(xian)粒體泄漏(lou)的 ICDHm（此(ci)步可選做）。

5、 在(zai)步驟④的沈澱中加(jia)入 200μl 試劑(ji)二和(he) 2μl 試劑(ji)三，超(chao)聲(sheng)波破碎(sui)（冰(bing)浴，功率 20％或(huo) 200W，超聲 3 秒，間(jian)隔(ge) 10 秒，重(zhong)復(fu) 30 次(ci)），用(yong)於(yu)線(xian)粒體 ICDHm 活性(xing)測(ce)定(ding)。

測(ce)定(ding)步驟：

1、分光(guang)光度計(ji)或(huo)酶(mei)標(biao)儀(yi)預熱 30min 以(yi)上(shang)，調節波長至(zhi) 340nm，蒸餾水(shui)調零。

2、樣(yang)本測定(ding)

在(zai)試劑(ji)五(wu)中加(jia)入 18ml 試劑(ji)四充(chong)分溶(rong)解(jie)，置(zhi)於(yu) 37℃（哺(bu)乳動物(wu)）或(huo) 25℃（其它物種）水浴 10min；用(yong)不(bu)完的試劑(ji)分裝(zhuang)後-20℃保存(cun)，禁止(zhi)反(fan)復(fu)凍融(rong)；

在(zai)試劑(ji)六(liu)中加(jia)入 1ml 蒸(zheng)餾水(shui)，充(chong)分溶(rong)解(jie)待用(yong)；用(yong)不(bu)完的試劑(ji)分裝(zhuang)後-20℃保存(cun)，禁止(zhi)反(fan)復(fu)凍融(rong)；

在(zai)微(wei)量石英比(bi)色(se)皿或(huo) 96 孔(kong)板中加(jia)入 10μl 樣(yang)本、10μl 試劑(ji)六(liu)和 180μl 試劑(ji)五(wu)，混(hun)勻(yun)，立(li)即(ji)記錄 340nm

處(chu) 20s 時的吸(xi)光(guang)值(zhi)A1 和(he) 2min20s 後的吸(xi)光(guang)值(zhi)A2，計(ji)算ΔA=A2-A1。

ICDHm 活(huo)性(xing)計(ji)算：

用(yong)微(wei)量石英比(bi)色(se)皿測定(ding)的計(ji)算公式(shi)如(ru)下

按樣(yang)本蛋(dan)白濃(nong)度計(ji)算

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織蛋(dan)白每(mei)分鐘生(sheng)成 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ICDHm 活(huo)性(xing)（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣(yang)) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本鮮重(zhong)計算

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每(mei)g 組(zu)織每(mei)分鐘生(sheng)成 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ICDHm（nmol/min/g 鮮重(zhong)）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=325×ΔA÷W

按細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)密(mi)度計算

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬個(ge)細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)每(mei)分鐘生(sheng)成 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ICDHm 活(huo)性(xing)（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=0.65×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反應(ying)體系總(zong)體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消(xiao)光(guang)系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色(se)皿光徑(jing)，1cm； V 樣(yang)：加(jia)入樣(yang)本體積，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提取(qu)液(ye)體積，0.202 ml；T：反應時間，2min；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白質(zhi)濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g；500：細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)總(zong)數，500 萬(wan)。

用(yong) 96 孔(kong)板測(ce)定(ding)的計(ji)算公式(shi)如(ru)下

按樣(yang)本蛋(dan)白濃(nong)度計(ji)算

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織蛋(dan)白每(mei)分鐘生(sheng)成 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ICDHm 活(huo)性(xing)（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本鮮重(zhong)計算

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每(mei)g 組(zu)織每(mei)分鐘生(sheng)成 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ICDHm（nmol/min/g 鮮重(zhong)）＝[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=650×ΔA÷W

按細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)密(mi)度計算

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每(mei) 1 萬個(ge)細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)在(zai)反應體系中每(mei)分鐘生(sheng)成 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ICDHm 活(huo)性(xing)（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=1.3×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反應(ying)體系總(zong)體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消(xiao)光(guang)系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔(kong)板光(guang)徑，0.5cm； V 樣(yang)：加(jia)入樣(yang)本體積，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入提取(qu)液(ye)體積，0.202 ml；T：反應時間，2min；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白質(zhi)濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g；500：細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)總(zong)數，500 萬(wan)。

線(xian)粒體異檸(ning)檬(meng)酸脫(tuo)氫酶(mei)試劑(ji)盒(he) 三羧酸