MCA 是線粒(li)體三羧(suo)酸循(xun)環的(de)第(di)壹(yi)個(ge)中(zhong)間產物，由檸(ning)檬(meng)酸合(he)酶(mei)催化(hua)乙酰 CoA 與(yu)草(cao)酰乙(yi)酸合(he)成(cheng)，其含(han)量是三(san)羧(suo)酸循(xun)環強度(du)的(de)主(zhu)要指標之(zhi)壹(yi)。
線粒(li)體檸檬(meng)酸含(han)量試(shi)劑盒(he) 三羧(suo)酸

線粒(li)體檸檬(meng)酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含(han)量試(shi)劑盒(he)說明(ming)書(shu)

微(wei)量法 100 管(guan)/96 樣(yang)

線粒(li)體檸檬(meng)酸含(han)量試(shi)劑盒(he) 三羧(suo)酸

正(zheng)式(shi)測定前(qian)務必(bi)取(qu) 2-3 個(ge)預(yu)期(qi)差(cha)異較(jiao)大(da)的(de)樣(yang)本做(zuo)預(yu)測定測定(ding)意(yi)義：

MCA 是線粒(li)體三羧(suo)酸循(xun)環的(de)第(di)壹(yi)個(ge)中(zhong)間產物，由檸(ning)檬(meng)酸合(he)酶(mei)催化(hua)乙酰 CoA 與(yu)草(cao)酰乙(yi)酸合(he)成(cheng)，其含(han)量是三(san)羧(suo)酸循(xun)環強度(du)的(de)主(zhu)要指標之(zhi)壹(yi)。配(pei)合(he)測(ce)定(ding)丙tong酸含(han)量、丙(bing)tong酸脫氫酶活(huo)性、乙(yi)酰 CoA 含(han)量、檸(ning)檬(meng)酸合(he)酶(mei)活性和(he) MCA 含(han)量，其中(zhong)（1）丙tong酸含(han)量和(he)丙(bing)tong酸脫氫酶活(huo)性變化(hua)可以反映(ying)糖(tang)酵(jiao)解進行(xing)程度，（2）綜(zong)合(he)分析(xi)丙(bing)tong酸含(han)量、丙(bing)tong酸脫氫酶活(huo)性和(he)乙(yi)酰CoA 含(han)量變化(hua)可以反映(ying)脂(zhi)肪酸β-氧(yang)化(hua)途徑提(ti)供的(de)乙酰 CoA 情(qing)況(kuang)，（3）乙(yi)酰CoA 含(han)量、檸(ning)檬(meng)酸合(he)酶(mei)活性和(he)MCA 含(han)量變化(hua)可以反映(ying)三(san)羧(suo)酸循(xun)環進(jin)行(xing)狀況(kuang)。

測(ce)定原理：

MCA 在(zai)檸檬(meng)酸裂(lie)解(jie)酶(mei)的(de)作用(yong)下(xia)，生成(cheng)α-酮酸（草(cao)酰乙(yi)酸）；在(zai)弱(ruo)酸性條(tiao)件下(xia)，α-酮酸進(jin)壹(yi)步(bu)與(yu)苯肼(jing)反應，生成(cheng)相(xiang)應(ying)的(de)α-酮酸苯(ben)腙(zong)；α-酮酸苯(ben)腙(zong)在 330nm 處(chu)有(you)吸收峰(feng)，該(gai)波長(chang)下(xia)吸光度(du)的(de)變化(hua)程度可(ke)反映(ying)出(chu) MCA的(de)含(han)量。

組成(cheng)：

試(shi)劑三(san)：粉劑(ji)×1 瓶(ping)，4℃保存；臨用前(qian)加入 6ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)充(chong)分溶解(jie)待用(yong)；用(yong)不完(wan)的(de)試(shi)劑 4℃保存；標準(zhun)液(ye)：液(ye)體 1ml×1 支，10μmol/ml 檸(ning)檬酸標準(zhun)液(ye)，4℃保存。

自(zi)備儀(yi)器和(he)用品(pin)：

分(fen)光光度(du)計/酶標儀(yi)、水(shui)浴鍋(guo)、可(ke)調式(shi)移液(ye)槍、微量石英(ying)比色(se)皿(min)/96 孔板(ban)（UV 板(ban)）、研缽(bo)、蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

線粒(li)體中(zhong)檸檬(meng)酸提(ti)取(qu)：

稱(cheng) 0.05~0.1g 樣(yang)品(pin)（建議(yi)稱(cheng) 0.1g 樣(yang)本），加入 0.5ml 酸性提(ti)取(qu)液(ye)，冰(bing)上充(chong)分研(yan)磨(mo)，600g/min 4℃離心 5min；取(qu)上清至另(ling)壹(yi)EP 管(guan)中(zhong)，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取(qu) 300μl 該上清液(ye)和 300μl 堿(jian)性提(ti)取(qu)液(ye)中(zhong)和後(hou)可(ke)用(yong)於細胞(bao)質(zhi)CA 含(han)量測(ce)定(ding)）；沈澱(dian)即(ji)線粒(li)體，向沈澱(dian)中(zhong)加入 0.5ml 酸性提(ti)取(qu)液(ye)，充(chong)分懸(xuan)浮(fu)溶解(jie)，超(chao)聲(sheng)波(bo)破碎（功(gong)率 20％，超聲(sheng) 3 秒，間隔(ge) 10 秒，重復(fu) 30 次(ci)），取(qu)此溶液(ye) 300μl 和 300μl 堿(jian)性提(ti)取(qu)液(ye)中(zhong)和，混(hun)勻，置冰(bing)上待測(ce)（不(bu)可用(yong)於蛋白(bai)質(zhi)含(han)量測(ce)定(ding)）。

測(ce)定步(bu)驟：

1、分(fen)光光度(du)計或酶標儀(yi)預熱(re) 30 min 以(yi)上，調節波長(chang)到(dao) 330nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調零(ling)。

2、試(shi)劑壹(yi)、二和三(san) 37℃預(yu)熱(re) 10min。

3、樣(yang)本測定(ding)：

空白(bai)管(guan)和(he)標準(zhun)管(guan)只需(xu)要各做(zuo)壹(yi)個(ge)。

充(chong)分混(hun)勻，330nm 立即(ji)測定初(chu)始吸(xi)光值(zhi)A1 和(he) 37℃孵(fu)育(yu) 30min 後(hou)的(de)吸光值(zhi)A2，ΔA=A2 –A1。

檸(ning)檬酸含(han)量計算(suan)：

按蛋(dan)白(bai)濃(nong)度(du)計算(suan)

檸(ning)檬酸含(han)量(μmol/mg prot)=[C 標準(zhun)管(guan)×(ΔA 測定(ding)管－ΔA 空白(bai)管(guan))÷(ΔA 標準(zhun)管(guan)－ΔA 空白(bai)管(guan)) ×V 樣(yang)]÷（V 樣(yang)÷Cpr）=10×(ΔA 測(ce)定管(guan)－ΔA 空白(bai)管(guan))÷(ΔA 標準(zhun)管(guan)－ΔA 空白(bai)管(guan))÷Cpr蛋(dan)白(bai)質(zhi)含(han)量需(xu)要另外(wai)測(ce)定(ding)。

按樣(yang)本鮮重(zhong)計算(suan)

檸(ning)檬酸含(han)量(μ mol/g 鮮(xian)重(zhong))=[C 標準(zhun)管(guan)×(ΔA 測定(ding)管－ΔA 空白(bai)管(guan))÷(ΔA 標準(zhun)管(guan)－ΔA 空白(bai)管(guan)) ×V 樣(yang)]÷（W×V樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)）=10×(ΔA 測定(ding)管(guan)－ΔA 空白(bai)管(guan))÷(ΔA 標準(zhun)管(guan)－ΔA 空白(bai)管(guan))÷W

C 標準(zhun)管(guan)：標準(zhun)液(ye)濃度，10μmol/ml； V 樣(yang)：加(jia)入反應體系中(zhong)樣(yang)本體積(ji)：0.06ml；V 樣(yang)總(zong)：加入提(ti)取(qu)液(ye)體積(ji)：1ml；Cpr：樣(yang)品(pin)蛋白(bai)濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g。

註意(yi)：最di檢(jian)測(ce)限(xian)為(wei) 10nmol/mg prot 或(huo) 1μmol/g 鮮(xian)重。

線粒(li)體檸檬(meng)酸含(han)量試(shi)劑盒(he) 三羧(suo)酸