MCS 廣(guang)泛存在於動物(wu)、植(zhi)物、微生物(wu)和(he)培養細(xi)胞的線粒體基(ji)質(zhi)中(zhong)，與(yu)檸(ning)檬(meng)酸(suan)合酶（CS）共同參(can)與三羧(suo)酸(suan)循(xun)環的調節(jie)。
甲基(ji)檸(ning)檬(meng)酸(suan)合酶試(shi)劑盒(he) 三羧(suo)酸(suan)

甲(jia)基(ji)檸(ning)檬(meng)酸(suan)合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）試(shi)劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

微(wei)量法 100 管(guan)/96 樣

甲(jia)基(ji)檸(ning)檬(meng)酸(suan)合酶試(shi)劑盒(he) 三羧(suo)酸(suan)

正(zheng)式測(ce)定前(qian)務(wu)必(bi)取 2-3 個(ge)預期差異較(jiao)大(da)的樣本做(zuo)預測(ce)定

測(ce)定意(yi)義：

MCS 廣(guang)泛存在於動物(wu)、植(zhi)物、微生物(wu)和(he)培養細(xi)胞的線粒體基(ji)質(zhi)中(zhong)，與(yu)檸(ning)檬(meng)酸(suan)合酶（CS）共同參(can)與三羧(suo)酸(suan)循(xun)環的調節(jie)。

測(ce)定原(yuan)理：

MCS 催(cui)化丙酰CoA 和(he)草酰乙酸(suan)產(chan)生(sheng)甲基(ji)檸(ning)檬(meng)酰(xian)輔meiA，進(jin)壹(yi)步(bu)水解產(chan)生(sheng)甲基(ji)檸(ning)檬(meng)酸(suan)；該(gai)反(fan)應促(cu)使(shi)無色(se)的DTNB 轉(zhuan)變成(cheng)黃色(se)的TNB，在 412nm 處有(you)特(te)征吸光(guang)值(zhi)。

組(zu)成：

試(shi)劑六(liu)：粉劑×1 支(zhi)，-20℃保(bao)存，臨(lin)用前加入 1ml 蒸(zheng)餾水(shui)，用(yong)不(bu)完的試(shi)劑仍(reng)-20℃保(bao)存；

自備儀器(qi)和(he)用品(pin)：

可(ke)見分(fen)光光(guang)度計/酶標(biao)儀、臺(tai)式離(li)心機(ji)、水(shui)浴(yu)鍋、可調(tiao)式移液(ye)器(qi)、微量(liang)石(shi)英(ying)比色皿(min)/96 孔板、研缽(bo)、冰(bing)、無(wu)水(shui)乙醇(chun)和(he)蒸(zheng)餾水(shui)

樣本的前處理(li)：

組(zu)織、細(xi)菌或(huo)細(xi)胞中(zhong)胞漿蛋白與(yu)線粒體蛋白(bai)的分(fen)離(li)：

稱(cheng)取約 0.1g 組(zu)織或收(shou)集(ji) 500 萬(wan)細(xi)胞，加入 1ml 試(shi)劑壹(yi)和(he) 10μl 試(shi)劑三，用(yong)冰(bing)浴(yu)勻漿器(qi)或研(yan)缽(bo)勻漿。將勻漿 600g，4℃離(li)心 5min。

棄(qi)沈澱，將(jiang)上清(qing)液(ye)移至(zhi)另(ling)壹(yi)離(li)心管(guan)中(zhong)，11000g，4℃離(li)心 10min。

上(shang)清液(ye)即(ji)胞漿提(ti)取物(wu)，可(ke)用(yong)於測(ce)定從線(xian)粒體泄漏(lou)的 CS（此(ci)步(bu)可選做(zuo)）。

在(zai)步驟(zhou)④的沈澱(dian)中(zhong)加(jia)入 200μl 試(shi)劑二(er)和(he) 2μl 試(shi)劑三，超(chao)聲(sheng)波破(po)碎（冰(bing)浴(yu)，功率 20％或(huo) 200W，超聲 3秒，間(jian)隔(ge) 10 秒，重復 30 次(ci)），用(yong)於(yu)線粒體 CS 測(ce)定。

測(ce)定步(bu)驟(zhou)：

1、分(fen)光光(guang)度計或(huo)酶標(biao)儀預熱 30min 以上(shang)，調(tiao)節波長(chang)至(zhi) 412nm，蒸(zheng)餾水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、樣本測(ce)定

在(zai)試(shi)劑五(wu)中(zhong)加(jia)入 1ml 無(wu)水乙醇(chun)和(he) 22ml 試(shi)劑四，混勻，37℃（哺乳動物(wu)）或(huo) 25℃（其(qi)它物(wu)種(zhong)）孵育 5min；用不(bu)完的試(shi)劑分(fen)裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存，禁(jin)止反復(fu)凍(dong)融；

在(zai)微量石(shi)英(ying)比色皿(min)或(huo) 96 孔板中(zhong)加(jia)入 10μl 樣本、220μl 試(shi)劑五(wu)和(he) 10μl 試(shi)劑六(liu)，混(hun)勻，記錄 412nm 處20 秒時(shi)的初始(shi)吸光(guang)度A1 和(he) 2 分(fen) 20 秒時(shi)的吸光(guang)度A2，計算(suan)ΔA=A2-A1。

MCS 活(huo)性計(ji)算(suan)：

使(shi)用微量(liang)石(shi)英(ying)比色皿(min)測(ce)定的計算(suan)公式如(ru)下(xia)：

按(an)樣本蛋(dan)白濃度計算(suan)：

單(dan)位的定義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織(zhi)蛋(dan)白每(mei)分(fen)鐘催(cui)化(hua)產(chan)生(sheng) 1 nmol TNB 定義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單(dan)位。 MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr此(ci)法(fa)需(xu)要(yao)自行測(ce)定樣本蛋(dan)白質(zhi)濃度。

按(an)樣本鮮(xian)重計算(suan)：

單(dan)位的定義(yi)：每(mei)g 組(zu)織(zhi)每(mei)分(fen)鐘催(cui)化(hua)產(chan)生(sheng) 1 nmol TNB 定義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單(dan)位。

MCS（nmol/min /g 鮮(xian)重）=[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞密度計算(suan)：

單(dan)位的定義(yi)：每(mei) 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞每(mei)分(fen)鐘催(cui)化(hua)產(chan)生(sheng) 1 nmol TNB 定義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單(dan)位。

MCS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.3556×ΔA

V 反(fan)總：反應體系總(zong)體積，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩(mo)爾消(xiao)光系(xi)數(shu)，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿(min)光(guang)徑，1cm； V 樣：加入(ru)樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加(jia)入提(ti)取液(ye)體積，0.202 ml；T：反(fan)應時(shi)間，2 min；Cpr：樣本蛋(dan)白質(zhi)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhi)量，g；500：細(xi)胞或細(xi)菌總(zong)數(shu)，500 萬(wan)。

使(shi)用 96 孔板測(ce)定的計算(suan)公式如(ru)下(xia)：

按(an)樣本蛋(dan)白濃度計算(suan)：

單(dan)位的定義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織(zhi)蛋(dan)白每(mei)分(fen)鐘催(cui)化(hua)產(chan)生(sheng) 1 nmol TNB 定義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單(dan)位。 MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr此(ci)法(fa)需(xu)要(yao)自行測(ce)定樣本蛋(dan)白質(zhi)濃度。

按(an)樣本鮮(xian)重計算(suan)：

單(dan)位的定義(yi)：每(mei)g 組(zu)織(zhi)每(mei)分(fen)鐘催(cui)化(hua)產(chan)生(sheng) 1 nmol TNB 定義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單(dan)位。

MCS（nmol/min /g 鮮(xian)重）=[ΔA×V 反總(zong)÷（ε×d）×109]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=355.6×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞密度計算(suan)：

單(dan)位的定義(yi)：每(mei) 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞每(mei)分(fen)鐘催(cui)化(hua)產(chan)生(sheng) 1 nmol TNB 定義(yi)為(wei)壹(yi)個(ge)酶活(huo)力單(dan)位。

MCS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.711×ΔA

V 反(fan)總：反應體系總(zong)體積，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩(mo)爾消(xiao)光系(xi)數(shu)，1.36×104 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入(ru)樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加(jia)入提(ti)取液(ye)體積，0.202 ml；T：反(fan)應時(shi)間，2 min；Cpr：樣本蛋(dan)白質(zhi)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhi)量，g；500：細(xi)胞或細(xi)菌總(zong)數(shu)，500 萬(wan)。

甲(jia)基(ji)檸(ning)檬(meng)酸(suan)合酶試(shi)劑盒(he) 三羧(suo)酸(suan)