MDH （EC 1.1.1.37）廣(guang)泛(fan)存在於(yu)動物、植物、微生物和培(pei)養細(xi)胞中(zhong)，線粒體中(zhong)MDH 是TCA 循環的關(guan)鍵酶(mei)之壹(yi)，催(cui)化蘋果(guo)酸(suan)形成(cheng)草(cao)酰乙(yi)酸(suan)；相反(fan)，胞漿(jiang)中 MDH 催(cui)化草酰乙(yi)酸(suan)形成(cheng)蘋(ping)果酸。草酰乙(yi)酸(suan)是(shi)重要的中(zhong)間產(chan)物， 連(lian)接(jie)多(duo)條重要的代(dai)謝途徑(jing)。
線粒體蘋(ping)果酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei) 三羧酸(suan)

線粒體蘋(ping)果酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei)（MDHm）試(shi)劑(ji)盒(he)說明(ming)書(shu)

微(wei)量(liang)法 100 管(guan)/96 樣(yang)

線粒體蘋(ping)果酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei) 三羧酸(suan)

正(zheng)式(shi)測定前務必取 2-3 個預(yu)期(qi)差(cha)異較大(da)的樣(yang)本做(zuo)預(yu)測定測定意(yi)義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣(guang)泛(fan)存在於(yu)動物、植物、微生物和培(pei)養細(xi)胞中(zhong)，線粒體中(zhong)MDH 是(shi)TCA 循環的關(guan)鍵酶(mei)之壹(yi)，催(cui)化蘋果(guo)酸(suan)形成(cheng)草(cao)酰乙(yi)酸(suan)；相反(fan)，胞漿(jiang)中 MDH 催(cui)化草酰乙(yi)酸(suan)形成(cheng)蘋(ping)果酸。草酰乙(yi)酸(suan)是(shi)重要的中(zhong)間產(chan)物， 連(lian)接(jie)多(duo)條重要的代(dai)謝途徑(jing)。因此，MDH 在(zai)細(xi)胞多(duo)種(zhong)生理活(huo)動(dong)中扮演(yan)著(zhe)重要的角(jiao)色，包括(kuo)線粒體的(de)能量(liang)代(dai)謝、 蘋(ping)果酸(suan)-天冬(dong)氨(an)酸(suan)穿(chuan)梭(suo)系(xi)統(tong)、活(huo)性氧(yang)代(dai)謝和(he)抗病(bing)性等(deng)。根(gen)據不(bu)同的輔酶(mei)特(te)異性，MDH分(fen)為(wei)NAD-依賴(lai)的MDH 和(he)NADP-依(yi)賴(lai)的MDH，細(xi)菌中通(tong)常(chang)只(zhi)含有 NAD-MDH，在(zai)真核細(xi)胞中(zhong)，NAD-MDH分(fen)布於(yu)細胞質(zhi)和線粒體中(zhong)。

測定原(yuan)理(li)：

MDHm 催(cui)化NADH 還(hai)原(yuan)草(cao)酰乙(yi)酸(suan)生成(cheng)蘋(ping)果酸，導致 340nm 處(chu)光(guang)吸(xi)收(shou)下(xia)降(jiang)。

組成(cheng)：

自(zi)備(bei)儀器(qi)和用(yong)品(pin)：

紫(zi)外(wai)分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)/酶(mei)標(biao)儀、臺式(shi)離(li)心(xin)機、水(shui)浴鍋、可調式(shi)移(yi)液(ye)器(qi)、微量(liang)石英(ying)比色皿/96 孔板和蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

樣(yang)本測定的(de)準(zhun)備(bei)：

組織、細菌(jun)或細(xi)胞中(zhong)胞漿(jiang)蛋(dan)白與(yu)線粒體蛋(dan)白的(de)分離：

1、 稱(cheng)取約(yue) 0.1g 組織或收(shou)集(ji) 500 萬(wan)細(xi)胞，加入(ru) 1ml 試(shi)劑(ji)壹(yi)和 10μl 試(shi)劑(ji)三，用冰(bing)浴勻漿(jiang)器(qi)或研(yan)缽勻漿(jiang)。

2、 將(jiang)勻漿(jiang)液(ye)於(yu) 600g，4℃離(li)心(xin) 5min。

3、 棄(qi)沈(chen)澱(dian)，將(jiang)上清(qing)液(ye)移(yi)至(zhi)另(ling)壹(yi)離心(xin)管(guan)中，11000g，4℃離(li)心(xin) 10min。

4、 上(shang)清液(ye)即胞漿(jiang)提取物，可用(yong)於(yu)測定從(cong)線粒體泄(xie)漏的(de) MDH（此(ci)步(bu)可選做(zuo)）。

5、 在(zai)步(bu)驟(zhou)④的(de)沈(chen)澱(dian)中(zhong)加入(ru) 200μl 試(shi)劑(ji)二(er)和 2μl 試(shi)劑(ji)三，超聲波破(po)碎（冰(bing)浴，功率(lv) 20％或 200W，超聲 3 秒(miao)，間隔(ge) 10 秒(miao)，重復 30 次），用(yong)於(yu) MDHm 活(huo)性測定。

測定步(bu)驟(zhou)：

1、分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)或酶(mei)標(biao)儀預(yu)熱(re) 30min 以上，調節(jie)波(bo)長(chang)至 340nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調零(ling)。

2、檢(jian)測工(gong)作液(ye)的配(pei)制：用時在試(shi)劑(ji)五(wu)中(zhong)加入(ru) 19ml 試(shi)劑(ji)四(si)和 0.5ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，充(chong)分(fen)混勻待用；用不(bu)完的(de)試(shi)劑(ji)分裝後-20℃保(bao)存，禁(jin)止反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)。

3、測定前將(jiang)檢測工(gong)作液(ye)在 37℃（哺(bu)乳動物）或 25℃（其它(ta)物種(zhong)）水浴 10min 以上。

4、在(zai)微量(liang)石英(ying)比色皿或 96 孔板中加入(ru) 5μl 樣(yang)本和(he) 195μl 工(gong)作液(ye)，混勻後立即記(ji)錄(lu) 340nm 處(chu) 20s 時的吸(xi)光(guang)值A1 和(he) 1min20s 後的(de)吸光(guang)值A2，計算(suan)ΔA=A1-A2。

MDHm 活(huo)力(li)單位的(de)計算(suan)：

用(yong)微量(liang)石英(ying)比色皿測定的(de)計算(suan)公式(shi)如(ru)下(xia)

按(an)樣(yang)本蛋(dan)白濃(nong)度計算(suan)：

單位的(de)定義：每mg 組織蛋(dan)白每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個酶(mei)活(huo)力(li)單位。

MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮(xian)重計算(suan)：

單位的(de)定義：每g 組織每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個酶(mei)活(huo)力(li)單位。

MDHm（nmol/min/g 鮮(xian)重）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總）÷T =1299×ΔA÷W

按(an)細菌或細(xi)胞密(mi)度計算(suan)：

單位的(de)定義：每 1 萬(wan)個細(xi)菌(jun)或細(xi)胞每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個酶(mei)活(huo)力(li)單位。

MDHm（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總）÷T=0.65×ΔA

V 反(fan)總：反(fan)應(ying)體系(xi)總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩(mo)爾(er)消光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比(bi)色皿光(guang)徑(jing)，1cm； V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本體(ti)積，0.005 ml；V 樣(yang)總：加入(ru)提取液(ye)體積，0.202ml；T：反(fan)應(ying)時間，1 min；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白質(zhi)濃度(du)，mg/ml；2000：細胞或細(xi)菌總數，2000 萬(wan)。

用(yong) 96 孔板測定的(de)計算(suan)公式(shi)如(ru)下(xia)

按(an)樣(yang)本蛋(dan)白濃(nong)度計算(suan)：

單位的(de)定義：每mg 組織蛋(dan)白每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個酶(mei)活(huo)力(li)單位。

MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮(xian)重計算(suan)：

單位的(de)定義：每g 組織每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個酶(mei)活(huo)力(li)單位。

MDHm（nmol/min/g 鮮(xian)重）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總）÷T =2598×ΔA÷W

按(an)細菌或細(xi)胞密(mi)度計算(suan)：

單位的(de)定義：每 1 萬(wan)個細(xi)菌(jun)或細(xi)胞每分鐘(zhong)消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個酶(mei)活(huo)力(li)單位。

MDHm（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×10⁹]÷（2000×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總）÷T=1.3×ΔA

V 反(fan)總：反(fan)應(ying)體系(xi)總體積，2×10^-4 L；ε：NADH 摩(mo)爾(er)消光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光(guang)徑(jing)，0.5cm； V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本體(ti)積，0.005 ml；V 樣(yang)總：加入(ru)提取液(ye)體積，0.202 ml；T：反(fan)應(ying)時間，1 min；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白質(zhi)濃度(du)，mg/ml；2000：細胞或細(xi)菌總數，2000 萬(wan)。

線粒體蘋(ping)果酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei) 三羧酸(suan)