順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶（aconitase），三羧(suo)酸(suan)循環(huan)中的酶(mei)，催化(hua)檸(ning)檬酸(suan)轉(zhuan)變為異(yi)檸檬酸(suan)。檸(ning)檬酸(suan)本(ben)身不易氧化(hua)，在(zai)順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶作用(yong)下(xia)，通(tong)過(guo)脫(tuo)水與(yu)加水反(fan)應，使羥基(ji)由(you)β碳原子轉(zhuan)移(yi)到α碳原子上(shang)，生(sheng)成(cheng)易於脫(tuo)氫(qing)氧(yang)化(hua)的異(yi)檸檬酸(suan)，為(wei)進壹步(bu)的氧(yang)化(hua)脫(tuo)羧反(fan)應作準備(bei)。
順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶ACO活性(xing)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒 三羧酸(suan)

順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶（ACO）活性(xing)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒說明書(shu)

微量法(fa) 100 管(guan)/96 樣

順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶ACO活性(xing)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒 三羧酸(suan)

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前(qian)務(wu)必(bi)取 2-3 個預(yu)期差異(yi)較大的樣本做預(yu)測(ce)定(ding)測(ce)定(ding)意義(yi)：

順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶（aconitase），三羧(suo)酸(suan)循環(huan)中的酶(mei)，催化(hua)檸(ning)檬酸(suan)轉(zhuan)變為異(yi)檸檬酸(suan)。檸(ning)檬酸(suan)本(ben)身不易氧化(hua)，在(zai)順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶作用(yong)下(xia)，通(tong)過(guo)脫(tuo)水與(yu)加水反(fan)應，使羥基(ji)由(you)β碳原子轉(zhuan)移(yi)到α碳原子上(shang)，生(sheng)成(cheng)易於脫(tuo)氫(qing)氧(yang)化(hua)的異(yi)檸檬酸(suan)，為(wei)進壹步(bu)的氧(yang)化(hua)脫(tuo)羧反(fan)應作準備(bei)。

測定(ding)原(yuan)理：

ACO 催化(hua)檸(ning)檬酸(suan)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)異(yi)檸檬酸(suan)，異(yi)檸檬酸(suan)氧(yang)化(hua)脫(tuo)羧將(jiang) NAD⁺ 還原(yuan)生(sheng)成(cheng)NADH，導致(zhi) 340nm 處光吸收(shou)上(shang)升(sheng)。

組成(cheng)：

試劑六(liu)：粉(fen)劑×1 支，-20℃保存；臨(lin)用(yong)前(qian)加 1.5ml 蒸餾(liu)水充(chong)分(fen)溶解；現配現(xian)用(yong)

試劑七：粉(fen)劑×1 支，4°保存；臨(lin)用(yong)前(qian)加 12ml 試劑(ji)四充(chong)分(fen)溶解；

工(gong)作液：臨(lin)用(yong)前(qian)在(zai) 12ml 試劑(ji)七中加入 1ml 蒸(zheng)餾水、1ml 試劑(ji)四、1ml 試(shi)劑五、1ml 試(shi)劑(ji)六(liu)充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)

自(zi)備(bei)儀(yi)器(qi)和用(yong)品：

紫(zi)外(wai)分(fen)光光度(du)計(ji)/酶標儀(yi)、水(shui)浴(yu)鍋、臺(tai)式離心(xin)機(ji)、可(ke)調(tiao)式移(yi)液器(qi)、微量石(shi)英比色皿(min)/96 孔(kong)板(ban)、研缽(bo)、冰(bing)和蒸餾(liu)水(shui)。

樣本的前(qian)處理(li)：

組織(zhi)、細(xi)菌或細(xi)胞(bao)中胞(bao)漿蛋(dan)白(bai)與(yu)線粒(li)體(ti)蛋白(bai)的分(fen)離：

1、 稱(cheng)取約(yue) 0.1g 組(zu)織(zhi)或收(shou)集(ji) 500 萬(wan)細(xi)胞(bao)，加入 1ml 試(shi)劑壹和 10μl 試(shi)劑三，用(yong)冰(bing)浴(yu)勻(yun)漿器(qi)或研缽(bo)勻(yun)漿。

2、 將勻(yun)漿轉(zhuan)入(ru)離心(xin)管(guan)內(nei) 600g，4℃離心(xin) 5min。

3、 棄沈澱，將上(shang)清液移(yi)至另壹離心(xin)管(guan)中，11000g，4℃離心(xin) 10min。

4、 上(shang)清液即(ji)胞(bao)漿提取物，可(ke)用(yong)於測定(ding)胞(bao)質順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶活性(xing)。

5、 在步(bu)驟④的沈澱中加入 200μl 試(shi)劑二和 2μl 試(shi)劑三，超(chao)聲(sheng)波破(po)碎（冰(bing)浴(yu)，功(gong)率(lv) 20％或 200W，超(chao)聲(sheng) 3 秒(miao)，間(jian)隔(ge) 10 秒(miao)，重復(fu) 30 次），用(yong)於線粒(li)體(ti)順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶活性(xing)測(ce)定(ding)。

測定(ding)步(bu)驟：

1、分(fen)光光度(du)計(ji)或酶(mei)標(biao)儀(yi)預(yu)熱 30min 以上(shang)，調節(jie)波長(chang)至 340nm，蒸(zheng)餾(liu)水調零。

2、樣本測定(ding)

（1）將工(gong)作液，置(zhi)於 37℃（哺(bu)乳(ru)動(dong)物）或 25℃（其(qi)它(ta)物種(zhong)）水(shui)浴(yu) 10min；現配(pei)現用(yong)；若分(fen)次(ci)用(yong)將工(gong)作液分(fen)裝後(hou)於-20°保存，壹(yi)星期內(nei)可(ke)用(yong)。

（3）在微量(liang)石(shi)英比色皿(min)或 96 孔(kong)板(ban)中加入 40μl 樣本 160μl 工(gong)作液，混勻(yun)，立即(ji)記(ji)錄 340nm 處 20s 時的吸(xi)光值A1 和(he) 3min20s 後的吸(xi)光值A2，計(ji)算(suan)ΔA=A2-A1。

ACO 活性(xing)計(ji)算(suan)：

用(yong)微量石(shi)英比色皿(min)測(ce)定(ding)的計(ji)算(suan)公式(shi)如(ru)下(xia)

按樣本蛋白(bai)濃(nong)度(du)計(ji)算(suan)

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每mg 組織(zhi)蛋(dan)白(bai)每(mei)分(fen)鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ACO 活性(xing)（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 樣) ÷T=268×ΔA÷Cpr

按樣本鮮(xian)重計(ji)算(suan)

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每g 組織(zhi)每(mei)分(fen)鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ACO（nmol/min/g 鮮(xian)重）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=54×ΔA÷W

按細菌或細(xi)胞(bao)密度(du)計(ji)算(suan)

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每 1 萬個細(xi)菌或細(xi)胞(bao)每分(fen)鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ACO 活性(xing)（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.108×ΔA

V 反總：反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)總體(ti)積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消(xiao)光系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿(min)光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.04 ml；V 樣總：加入提取液(ye)體(ti)積，0.202 ml；T：反(fan)應時間(jian)，3min；Cpr：樣本蛋白(bai)質(zhi)濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細(xi)菌或細(xi)胞(bao)總數(shu)，500 萬。

用(yong) 96 孔(kong)板(ban)測定(ding)的計(ji)算(suan)公式(shi)如(ru)下(xia)

按樣本蛋白(bai)濃(nong)度(du)計(ji)算(suan)

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每mg 組織(zhi)蛋(dan)白(bai)每(mei)分(fen)鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ACO 活性(xing)（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr

按樣本鮮(xian)重計(ji)算(suan)

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每g 組織(zhi)每(mei)分(fen)鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ACO（nmol/min/g 鮮(xian)重）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=108×ΔA÷W

按細菌或細(xi)胞(bao)密度(du)計(ji)算(suan)

單位(wei)的定(ding)義(yi)：每 1 萬個細(xi)菌或細(xi)胞(bao)在反(fan)應體系中每(mei)分(fen)鐘(zhong)生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的NADH 定(ding)義(yi)為壹個酶(mei)活性(xing)單位(wei)。

ACO 活性(xing)（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.216×ΔA

V 反總：反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)總體(ti)積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消(xiao)光系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔(kong)板(ban)光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.04 ml；V 樣總：加入提取液(ye)體(ti)積，0.202 ml；T：反(fan)應時間(jian)，3min；Cpr：樣本蛋白(bai)質(zhi)濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細(xi)菌或細(xi)胞(bao)總數(shu)，500 萬。

順(shun)烏(wu)頭(tou)酸酶ACO活性(xing)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒 三羧酸(suan)