葉(ye)綠(lv)體(ti)復合(he)體Ⅴ又稱(cheng)F1F0-ATP 合(he)酶，由 F1 和(he)F0 兩(liang)個亞單(dan)位組(zu)成(cheng)。該酶利(li)用(yong)呼(hu)吸(xi)鏈(lian)產生的質子(zi)電(dian)化學梯度催化(hua)ATP 合(he)成(cheng)，也(ye)可逆(ni)過(guo)程(cheng)水(shui)解(jie) ATP。復合(he)體Ⅴ是線(xian)粒(li)體(ti)氧(yang)化(hua)磷酸化(hua)和葉(ye)綠(lv)體(ti)光(guang)合(he)磷酸化(hua)合(he)成(cheng)ATP的關(guan)鍵(jian)酶(mei)。
葉(ye)綠(lv)體(ti)復合(he)體Ⅴ試劑(ji)盒(he) 氧化(hua)磷酸化(hua)

葉(ye)綠(lv)體(ti)復合(he)體Ⅴ試劑(ji)盒說(shuo)明書(shu)

分光(guang)光(guang)度法(fa) 25 管/12 樣(yang)

葉(ye)綠(lv)體(ti)復合(he)體Ⅴ試劑(ji)盒(he) 氧化(hua)磷酸化(hua)

正式測(ce)定前務必(bi)取 2-3 個預(yu)期(qi)差異(yi)較大的樣(yang)本做(zuo)預(yu)測(ce)定測(ce)定意義(yi)：

葉(ye)綠(lv)體(ti)復合(he)體Ⅴ又稱(cheng)F1F0-ATP 合(he)酶，由 F1 和F0 兩(liang)個亞單(dan)位組(zu)成(cheng)。該酶利(li)用(yong)呼(hu)吸(xi)鏈(lian)產生的質子(zi)電(dian)化學梯度催化(hua)ATP 合(he)成(cheng)，也(ye)可逆(ni)過(guo)程(cheng)水(shui)解(jie) ATP。復合(he)體Ⅴ是線(xian)粒(li)體(ti)氧(yang)化(hua)磷酸化(hua)和葉(ye)綠(lv)體(ti)光(guang)合(he)磷酸化(hua)合(he)成(cheng)ATP的關(guan)鍵(jian)酶(mei)。

測(ce)定原(yuan)理：

復合(he)體Ⅴ水解(jie)ATP 產生ADP 和Pi，通過測(ce)定Pi 增(zeng)加速(su)率(lv)來測(ce)定復合(he)體Ⅴ活性。

組(zu)成(cheng)：

試劑(ji)二：粉(fen)劑×1 支，-20℃保存；臨(lin)用(yong)前每支加入(ru) 1.3ml 蒸餾(liu)水，充(chong)分溶(rong)解(jie)備(bei)用，用不(bu)完的試劑(ji)仍-20℃保存；

試劑(ji)四：粉劑×1 瓶(ping)，4℃保存；臨(lin)用(yong)前加入(ru) 3ml 蒸餾(liu)水，充(chong)分混勻(yun)；溶(rong)解(jie)後(hou) 4℃保存壹周；試(shi)劑(ji)五：粉(fen)劑(ji)×1 瓶(ping), 4℃保存；臨(lin)用(yong)前加入(ru) 10ml 蒸餾(liu)水，充(chong)分混勻(yun)；溶(rong)解(jie)後(hou) 4℃保存壹周；試(shi)劑(ji)六：粉(fen)劑(ji)×1 瓶(ping), 4℃保存；臨(lin)用(yong)前加入(ru) 10ml 蒸餾(liu)水，充(chong)分混勻(yun)；溶(rong)解(jie)後(hou) 4℃保存壹周；

定磷(lin)試劑(ji)的配(pei)制(zhi)：按(an)H2O: 試劑(ji)五:試(shi)劑六:試(shi)劑七(qi)=2:1:1:1 的比(bi)例配(pei)制(zhi)，配(pei)好的定磷(lin)試劑(ji)應為(wei)淺(qian)黃(huang)色。若(ruo)無(wu)色(se)則試劑(ji)失(shi)效，若(ruo)是(shi)藍(lan)色則為磷(lin)汙(wu)染（請根據需(xu)要，用多(duo)少(shao)配(pei)多(duo)少(shao)）；

註意：配(pei)試(shi)劑(ji)最(zui)好用新的燒杯、玻棒(bang)和(he)玻璃移液器，或者(zhe)壹次(ci)性塑料器皿(min)，以(yi)避(bi)免(mian)磷(lin)汙(wu)染。

需(xu)自備(bei)儀器和用(yong)品(pin)：

可見(jian)分光(guang)光(guang)度計(ji)、臺式(shi)離(li)心(xin)機、水(shui)浴(yu)鍋、可調式移液器、1ml 玻璃比(bi)色皿(min)、研(yan)缽、冰和(he)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

葉(ye)綠(lv)體(ti)的提取(qu)：

1、稱(cheng)取(qu)約(yue) 0.1g 組(zu)織(zhi)或(huo)收(shou)集(ji) 500 萬細(xi)胞，加入(ru) 1ml 試劑(ji)壹，用冰(bing)浴(yu)勻(yun)漿(jiang)器或研(yan)缽勻(yun)漿(jiang)，很(hen)快(kuai)研(yan)磨(mo)或(huo)搗(dao)碎(sui)，30 秒內(nei)完成(cheng)，使之(zhi)成(cheng)為(wei)勻(yun)漿(jiang)液(ye)。

2、將勻(yun)漿(jiang)液(ye)於(yu) 200g（離心(xin)率），4℃離(li)心(xin) 1min。

3、棄沈(chen)澱，將上清(qing)液(ye)移至(zhi)另壹離心(xin)管中，1500g，4℃離心(xin) 5min。

4、棄上清(qing)液(ye)，於沈(chen)澱中加(jia)入(ru) 0.5ml 試劑(ji)壹混勻(yun)配(pei)成(cheng)葉(ye)綠(lv)體(ti)懸(xuan)浮(fu)液(ye)。混勻(yun)後(hou)測(ce)定葉(ye)綠(lv)體(ti)酶(mei)活性。

測(ce)定步(bu)驟：

1、酶促(cu)反(fan)應

混勻(yun)， 37℃（哺乳(ru)動物(wu)）或 25℃（其(qi)它物(wu)種(zhong)）準(zhun)確水浴(yu) 30min

混勻(yun)，4000g，25℃離心(xin) 10min，取上清(qing)液(ye)

2、定磷(lin)

混勻(yun)，室溫(wen)靜置 10min 左右，在(zai) 660nm 處讀取(qu)A 測(ce)定管和A 對照管，計(ji)算ΔA=A 測(ce)定管-A 對照管。

復合(he)體Ⅴ活性計(ji)算：

標(biao)準(zhun)條件(jian)下(xia)測(ce)定的回(hui)歸(gui)方(fang)程(cheng)為(wei)y = 1.274x + 0.004；x 為標(biao)準(zhun)品(pin)濃度（mmol/L），y 為A 值(zhi)。組(zu)織(zhi)中(zhong)復合(he)體Ⅴ活性的計(ji)算:

按樣(yang)本蛋(dan)白(bai)濃(nong)度計(ji)算

單位(wei)的定義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織(zhi)蛋(dan)白(bai)每(mei)分(fen)鐘產生 1 nmol 無機(ji)磷定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶(mei)活(huo)性單(dan)位(wei)。 復合(he)體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反(fan)總×106]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此(ci)法(fa)需(xu)要自行測(ce)定樣(yang)本蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃(nong)度。

按樣(yang)本鮮重(zhong)計(ji)算

單位(wei)的定義(yi)：每(mei)g 組(zu)織(zhi)每(mei)分(fen)鐘(zhong)產生 1 nmol 無機(ji)磷定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶(mei)活(huo)性單(dan)位(wei)。

復合(he)體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重(zhong)）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反(fan)總×106]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總) ÷T =31.37× (ΔA-0.004) ÷W

按細(xi)菌或(huo)細胞密(mi)度計(ji)算

單位(wei)的定義(yi)：每(mei) 1 萬個(ge)細菌(jun)或細胞每分(fen)鐘(zhong)產生 1 nmol 無機(ji)磷定(ding)義(yi)為(wei)壹個酶(mei)活(huo)性單(dan)位(wei)。

復合(he)體Ⅴ活性（nmol/min /104 cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反(fan)總×106]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總) ÷T=0.063× (ΔA-0.004)

V 反(fan)總：反(fan)應體(ti)系(xi)總(zong)體積，3×10-4 L； V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本體(ti)積(ji)，0.125 ml；V 樣(yang)總：加(jia)入(ru)提取(qu)液(ye)體(ti)積，0.5 ml；T：反(fan)應時間(jian)，30 min；Cpr：樣(yang)本蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本質(zhi)量(liang)，g；500：細(xi)胞或細(xi)菌(jun)總數(shu)，500 萬。

葉(ye)綠(lv)體(ti)復合(he)體Ⅴ試劑(ji)盒(he) 氧化(hua)磷酸化(hua)