CAD 是木質素(su)生物(wu)合成途徑(jing)中的關鍵酶(mei)之壹，是木質素(su)單(dan)體(ti)合成反(fan)應(ying)中的最(zui)後壹(yi)步(bu)，催化(hua)多種不同(tong)的肉桂醛（香豆(dou)醛、芥(jie)子醛(quan)以(yi)及(ji)松(song)柏(bai)醛(quan)等(deng)）生成與(yu)之相(xiang)應的(de)肉桂醇。該(gai)酶(mei)多存(cun)在(zai)於高(gao)等(deng)植(zhi)物(wu)、酵(jiao)母、菌類中，研究(jiu)該(gai)酶(mei)可(ke)以(yi)探(tan)討多(duo)種生物(wu)細胞(bao)發育過程(cheng)中木質素(su)沈積的代(dai)謝機理，為(wei)減少(shao)水果石(shi)細胞(bao)含量(liang)提高(gao)其品質提(ti)供(gong)依(yi)據(ju)。
肉桂醇脫氫(qing)酶(mei)試(shi)劑(ji)盒 其他(ta)系列(lie)

肉桂醇脫氫(qing)酶(mei)（ Cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD)試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明書

微量法 100 管(guan)/96 樣(yang)

肉桂醇脫氫(qing)酶(mei)試(shi)劑(ji)盒 其他(ta)系列(lie)

正式測定(ding)前(qian)務(wu)必取(qu) 2-3 個(ge)預期差(cha)異(yi)較大的(de)樣(yang)本做預測定(ding)測定(ding)意(yi)義：

CAD 是木質素(su)生物(wu)合成途徑(jing)中的關鍵酶(mei)之壹，是木質素(su)單(dan)體(ti)合成反(fan)應(ying)中的最(zui)後壹(yi)步(bu)，催化(hua)多種不同(tong)的肉桂醛（香豆(dou)醛、芥(jie)子醛(quan)以(yi)及(ji)松(song)柏(bai)醛(quan)等(deng)）生成與(yu)之相(xiang)應的(de)肉桂醇。該(gai)酶(mei)多存(cun)在(zai)於高(gao)等(deng)植(zhi)物(wu)、酵(jiao)母、菌類中，研究(jiu)該(gai)酶(mei)可(ke)以(yi)探(tan)討多(duo)種生物(wu)細胞(bao)發育過程(cheng)中木質素(su)沈積的代(dai)謝機理，為(wei)減少(shao)水果石(shi)細胞(bao)含量(liang)提高(gao)其品質提(ti)供(gong)依(yi)據(ju)。

測定(ding)原(yuan)理：

CAD 催(cui)化(hua)肉桂醇和(he)NADP 生(sheng)成肉桂醛和(he)NADPH，在(zai) 340nm 下測定(ding)NADPH 生(sheng)成速(su)率，即(ji)可(ke)反(fan)映(ying) CAD活(huo)性(xing)。

試(shi)劑(ji)的組成和(he)配(pei)制：

需(xu)自(zi)備(bei)的儀(yi)器和(he)用品：

紫(zi)外分光光度計(ji)/酶(mei)標(biao)儀(yi)、臺式離心(xin)機、可(ke)調式(shi)移(yi)液(ye)器(qi)、微量石(shi)英(ying)比色(se)皿(min)/96 孔(kong)板(ban)、研(yan)缽(bo)、冰(bing)和(he)蒸餾(liu)水。

粗酶(mei)液(ye)提(ti)取：

細(xi)菌或(huo)培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)：

先收(shou)集(ji)細(xi)菌或(huo)細胞到(dao)離心(xin)管內(nei)，離心(xin)後棄上(shang)清；按(an)照細菌或(huo)細胞數量(liang)（104 個(ge)）：提(ti)取液(ye)體(ti)積（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比例(li)（建議 500 萬(wan)細(xi)菌或(huo)細胞加入 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)），超聲(sheng)波(bo)破(po)碎(sui)細(xi)菌或(huo)細胞（冰(bing)浴(yu)，功(gong)率(lv) 20％或(huo) 200W，超聲(sheng) 3s，間(jian)隔(ge) 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心(xin) 10min，取上(shang)清，置(zhi)冰(bing)上(shang)待(dai)測。

組織：

按(an)照(zhao)組織質量(liang)（g）：提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ml)為(wei) 1：5~10 的(de)比例(li)（建議稱(cheng)取(qu)約(yue) 0.1g 組織，加入 1ml 提(ti)取(qu)液(ye)），進行冰(bing)浴(yu)勻(yun)漿。8000g 4℃離心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清，置(zhi)冰(bing)上(shang)待(dai)測。

測定(ding)步(bu)驟(zhou)：

1、分(fen)光光度計(ji)或(huo)酶(mei)標(biao)儀(yi)預熱 30min 以(yi)上(shang)，調節(jie)波(bo)長至 340nm，蒸餾(liu)水調零(ling)。

2、樣(yang)本測定(ding)

在(zai)試(shi)劑(ji)二中加入 10ml 試(shi)劑(ji)壹充(chong)分溶(rong)解(jie)混(hun)勻(yun)，室(shi)溫使用渦(wo)旋(xuan)振(zhen)蕩儀(yi)振(zhen)蕩溶(rong)解(jie) 15min，如(ru)未(wei)溶(rong)解可(ke)適當(dang)延(yan)長振(zhen)蕩時(shi)間(jian)；置於 37℃（哺(bu)乳(ru)動(dong)物(wu)）或(huo) 25℃（其(qi)它(ta)物(wu)種）水浴(yu) 5min；現配(pei)現用（配(pei)好後 24h 內(nei)用完）；

在(zai)微量石(shi)英(ying)比色(se)皿(min)或(huo) 96 孔(kong)板(ban)中加入 10μl 樣(yang)本和(he) 190μl 試(shi)劑(ji)二，混(hun)勻(yun)，立即(ji)記錄(lu) 340nm 處(chu)初始(shi)吸(xi)光值(zhi)A1 和(he) 5min 後的(de)吸光值(zhi)A2，計算(suan)ΔA=A2-A1。

CAD 活(huo)性(xing)計(ji)算(suan)：

a、用微量石(shi)英(ying)比色(se)皿(min)測定(ding)的(de)計算(suan)公式如(ru)下：

按(an)樣(yang)本蛋白濃(nong)度計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義：每(mei)mg 組織蛋白每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1 nmol 的(de)NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

CAD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮(xian)重計算：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義：每(mei)g 組織每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1 nmol NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

CAD（nmol/min/g 鮮(xian)重）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總) ÷T=643×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌或(huo)細胞密度計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義：每(mei) 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌或(huo)細胞每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1 nmol NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

CAD（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總) ÷T=1.286×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反(fan)應(ying)體(ti)系總(zong)體(ti)積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾(er)消光系數(shu)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色(se)皿(min)光徑(jing)，1cm；V 樣(yang)：加入樣(yang)本體(ti)積，0.01 ml；V 樣(yang)總：加(jia)入提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積，1 ml；T：反(fan)應(ying)時(shi)間(jian)，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本質量(liang)，g；500：細(xi)菌或(huo)細胞總數(shu)，500 萬(wan)。

b、用 96 孔(kong)板(ban)測定(ding)的(de)計算(suan)公式如(ru)下:

1）按(an)樣(yang)本蛋白濃(nong)度計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義：每(mei)mg 組織蛋白每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1 nmol 的(de)NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

CAD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮(xian)重計算：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義：每(mei)g 組織每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1 nmol NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

CAD（nmol/min/g 鮮(xian)重）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=1286×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌或(huo)細胞密度計(ji)算(suan)：

單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義：每(mei) 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌或(huo)細胞每(mei)分(fen)鐘產(chan)生 1 nmol NADPH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活力(li)單(dan)位(wei)。

CAD（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=2.572×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反(fan)應(ying)體(ti)系總(zong)體(ti)積，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾(er)消光系數(shu)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔(kong)板光徑(jing)，0.5cm；V 樣(yang)：加(jia)入樣(yang)本體(ti)積，0.01 ml；V 樣(yang)總：加(jia)入提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積，1 ml；T：反(fan)應(ying)時(shi)間(jian)，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃(nong)度，mg/ml；W：樣(yang)本質量(liang)，g；500：細(xi)菌或(huo)細胞總數(shu)，500 萬(wan)。

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