4CL 是(shi)連(lian)接苯(ben)丙酸(suan)途(tu)徑與木(mu)質素特異合成(cheng)途(tu)徑的(de)關鍵(jian)酶，主(zhu)要催(cui)化(hua)肉(rou)桂酸生(sheng)成(cheng)相(xiang)應(ying)的(de)肉桂酸輔meiA酯，是(shi)合(he)成(cheng)木(mu)質素與其(qi)他(ta)苯(ben)丙烷(wan)類化(hua)合物(wu)的代謝流向調(tiao)控(kong)點。該酶主(zhu)要存(cun)在於(yu)高(gao)等(deng)植物(wu)、酵(jiao)母(mu)和菌類(lei)中(zhong)，研(yan)究該(gai)酶可以探(tan)討多種生(sheng)物細(xi)胞(bao)發育(yu)過程(cheng)中(zhong)木(mu)質素沈(chen)積(ji)的(de)代謝機(ji)理，為(wei)減(jian)少水(shui)果石細(xi)胞(bao)含(han)量而提高(gao)其(qi)品(pin)質(zhi)提(ti)供(gong)依(yi)據(ju)。
4-香豆酸(suan)：輔(fu)meiA 連(lian)接酶試劑盒(he) 其(qi)他(ta)系列(lie)

4-香豆酸(suan)：輔(fu)meiA 連(lian)接酶（ 4-coumarate:CoA ligase，4CL)試劑盒(he)說明書(shu)

微(wei)量法(fa) 100 管(guan)/48 樣(yang)

4-香豆酸(suan)：輔(fu)meiA 連(lian)接酶試劑盒(he) 其(qi)他(ta)系列(lie)

正(zheng)式(shi)測定前(qian)務必(bi)取 2-3 個(ge)預期(qi)差(cha)異較(jiao)大(da)的(de)樣(yang)本做預測定測定意(yi)義：

4CL 是(shi)連(lian)接苯(ben)丙酸(suan)途(tu)徑與木(mu)質素特異合成(cheng)途(tu)徑的(de)關鍵(jian)酶，主(zhu)要催(cui)化(hua)肉(rou)桂酸生(sheng)成(cheng)相(xiang)應(ying)的(de)肉桂酸輔meiA酯，是(shi)合(he)成(cheng)木(mu)質素與其(qi)他(ta)苯(ben)丙烷(wan)類化(hua)合物(wu)的代謝流向調(tiao)控(kong)點。該酶主(zhu)要存(cun)在於(yu)高(gao)等(deng)植物(wu)、酵(jiao)母(mu)和菌類(lei)中(zhong)，研(yan)究該(gai)酶可以探(tan)討多種生(sheng)物細(xi)胞(bao)發育(yu)過程(cheng)中(zhong)木(mu)質素沈(chen)積(ji)的(de)代謝機(ji)理，為(wei)減(jian)少水(shui)果石細(xi)胞(bao)含(han)量而提高(gao)其(qi)品(pin)質(zhi)提(ti)供(gong)依(yi)據(ju)。

測定原(yuan)理：

4CL 催(cui)化(hua) 4-香豆酸(suan)和(he)CoA 生(sheng)成(cheng) 4-香豆酸(suan)CoA，在(zai) 333nm 下測 4-香豆酸(suan)CoA 生(sheng)成(cheng)速(su)率，即可反映(ying) 4CL活(huo)性。

試(shi)劑(ji)的組成(cheng)和(he)配制(zhi)：

需(xu)自(zi)備(bei)的儀(yi)器(qi)和(he)用品(pin)：

紫(zi)外(wai)分(fen)光光(guang)度計(ji)/酶標儀(yi)、臺(tai)式(shi)離(li)心(xin)機(ji)、可調(tiao)式(shi)移液(ye)器、微(wei)量石英比(bi)色(se)皿(min)/96 孔(kong)板（UV 板）、研(yan)缽、冰和蒸(zheng)餾水。

粗(cu)酶液提取：

細(xi)菌(jun)或(huo)培養細胞(bao)：

先(xian)收(shou)集(ji)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)到離(li)心(xin)管(guan)內(nei)，離(li)心(xin)後(hou)棄上(shang)清；按(an)照(zhao)細菌(jun)或(huo)細胞(bao)數量（104 個(ge)）：提(ti)取液(ye)體(ti)積（ml）為 500~1000：1 的比(bi)例(li)（建(jian)議(yi) 500 萬(wan)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)加(jia)入(ru) 1ml 提取液(ye)），超(chao)聲(sheng)波(bo)破(po)碎(sui)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)（冰浴，功(gong)率20％或(huo) 200W，超聲(sheng) 3s，間(jian)隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清，置冰上(shang)待測。

組(zu)織(zhi)：

按(an)照(zhao)組織(zhi)質(zhi)量（g）：提(ti)取液(ye)體(ti)積(ml)為 1：5~10 的比(bi)例(li)（建(jian)議(yi)稱(cheng)取約(yue) 0.1g 組(zu)織，加(jia)入(ru) 1ml 提取液(ye)），進行(xing)冰浴勻(yun)漿。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清，置冰上(shang)待測。

測定步(bu)驟：

1、分(fen)光光(guang)度計(ji)或(huo)酶標儀(yi) 40℃預熱(re) 30min 以(yi)上(shang)，調節(jie)波(bo)長(chang)至(zhi) 333nm，蒸(zheng)餾水調(tiao)零(ling)。

準(zhun)備(bei) 96 孔(kong)UV 板壹塊（非普通酶標板，普通酶標板只(zhi)能(neng)透(tou)過可(ke)見(jian)光(guang)，不能(neng)透(tou)過紫(zi)外(wai)光(guang)，檢測波(bo)長(chang)小(xiao)於(yu) 340nm 務必(bi)使(shi)用UV 板）。

2、樣(yang)本測定

在(zai)試(shi)劑二(er)中(zhong)加(jia)入(ru) 5ml 試劑(ji)壹(yi)充(chong)分(fen)溶解混勻(yun)，置於(yu) 40℃水(shui)浴預熱(re) 10min；現(xian)配現(xian)用（配(pei)好(hao)後 24h內(nei)用完(wan)）；

對(dui)照(zhao)管(guan)：在微(wei)量石英比(bi)色(se)皿(min)或(huo) 96 孔UV 板中(zhong)加(jia)入(ru) 10μl 樣(yang)本和 190μl 試劑(ji)壹(yi)，混勻(yun)，立(li)即記錄 333nm處(chu) 40℃反應 30min 後的吸光(guang)值(zhi)A1。

測定管(guan)：在微(wei)量石英比(bi)色(se)皿(min)或(huo) 96 孔UV 板中(zhong)加(jia)入(ru) 10μl 樣(yang)本和 190μl 試劑(ji)二(er)，混勻(yun)，立(li)即記錄 333nm處(chu) 40℃反應 30min 後的吸光(guang)值(zhi)A2，計(ji)算(suan)ΔA=A2-A1。每(mei)個測定管(guan)設壹(yi)個(ge)對(dui)照(zhao)管(guan)。

4CL 活(huo)性計(ji)算(suan)：

用微(wei)量石英比(bi)色(se)皿(min)測定的(de)計(ji)算(suan)公(gong)式(shi)如下

按(an)樣(yang)本蛋白濃(nong)度(du)計(ji)算(suan)：

單(dan)位定義：每(mei) mg 組織(zhi)蛋白每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成(cheng) 1 nmol4-香豆酸(suan)輔(fu)meiA 定義為(wei)壹(yi)個酶活力單(dan)位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮重計(ji)算(suan)：

單(dan)位定義：每(mei) g 組織(zhi)每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成(cheng) 1 nmol 4-香豆酸(suan)輔(fu)meiA 定義為(wei)壹(yi)個酶活力單(dan)位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=31.75×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌或(huo)細胞(bao)密度計(ji)算(suan)：

單(dan)位定義：每(mei) 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成(cheng) 1 nmol 4-香豆酸(suan)輔(fu)meiA 定義為(wei)壹(yi)個酶活力單(dan)位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=0.063×ΔA

V 反總：反應體系總體(ti)積，2×10-4 L；ε：4-香豆酸(suan)輔(fu)meiA 摩爾消(xiao)光系數，2.1×104 L / mol /cm；d：比(bi) 色(se)皿(min)光(guang)徑(jing)，1cm；V 樣(yang)：加(jia)入(ru)樣(yang)本體積，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入(ru)提取液(ye)體(ti)積，1 ml；T：反應時間(jian)，30 min； Cpr：樣(yang)本蛋白質(zhi)濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本質量，g；500：細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)總數(shu)，500 萬(wan)。

用 96 孔(kong)板測定的(de)計(ji)算(suan)公(gong)式(shi)如下

1）按(an)樣(yang)本蛋白濃(nong)度(du)計(ji)算(suan)：

單(dan)位的定義：每(mei)mg 組織(zhi)蛋白每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成(cheng) 1 nmol 的(de) 4-香豆酸(suan)輔(fu)meiA 定義為(wei)壹(yi)個酶活力單(dan)位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=63.49×ΔA÷Cpr

按(an)樣(yang)本鮮重計(ji)算(suan)：

單(dan)位的定義：每(mei)g 組織(zhi)每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成(cheng) 1 nmol 4-香豆酸(suan)輔(fu)meiA 定義為(wei)壹(yi)個酶活力單(dan)位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong)) ÷T=63.49×ΔA÷W

按(an)細(xi)菌或(huo)細胞(bao)密度計(ji)算(suan)：

單(dan)位的定義：每(mei) 1 萬(wan)個(ge)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)每(mei)分(fen)鐘生(sheng)成(cheng) 1 nmol 4-香豆酸(suan)輔(fu)meiA 定義為(wei)壹(yi)個酶活力單(dan)位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=0.127×ΔA

V 反總：反應體系總體(ti)積，2×10-4 L；ε：4-香豆酸(suan)輔(fu)meiA 摩爾消(xiao)光系數，2.1×104 L / mol /cm；d：96 孔(kong)板光徑，0.5cm；V 樣(yang)：加(jia)入(ru)樣(yang)本體積，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加(jia)入(ru)提取液(ye)體(ti)積，1 ml；T：反應時間(jian)，30 min； Cpr：樣(yang)本蛋白質(zhi)濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本質量，g；500：細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)總數(shu)，500 萬(wan)。

4-香豆酸(suan)：輔(fu)meiA 連(lian)接酶試劑盒(he) 其(qi)他(ta)系列(lie)