莽草酸途(tu)徑(jing)是(shi)存(cun)在於(yu)植物、真(zhen)菌和(he)微生物中(zhong)的(de)壹(yi)條重(zhong)要的(de)代謝(xie)途(tu)徑(jing)，莽(mang)草酸脫(tuo)氫酶(mei)是(shi)莽(mang)草酸合(he)成(cheng)途(tu)徑(jing)中(zhong)的(de)關(guan)鍵酶(mei)。
莽草酸脫(tuo)氫酶(mei)試劑(ji)盒(he) 其(qi)他系列

莽(mang)草酸脫(tuo)氫酶(mei)（Shikimate dehydrogenase，SD）試劑(ji)盒(he)說明(ming)書

微量法(fa) 100 管/96 樣(yang)

莽(mang)草酸脫(tuo)氫酶(mei)試劑(ji)盒(he) 其(qi)他系列

正(zheng)式測定(ding)前務(wu)必取 2-3 個預(yu)期差(cha)異(yi)較(jiao)大(da)的樣(yang)本(ben)做(zuo)預(yu)測定(ding)測定(ding)意義：

莽(mang)草酸途(tu)徑(jing)是(shi)存(cun)在於(yu)植物、真(zhen)菌和(he)微生物中(zhong)的(de)壹(yi)條重(zhong)要的(de)代謝(xie)途(tu)徑(jing)，莽(mang)草酸脫(tuo)氫酶(mei)是(shi)莽(mang)草酸合(he)成(cheng)途(tu)徑(jing)中(zhong)的(de)關(guan)鍵酶(mei)。

測定(ding)原理(li)：

莽(mang)草酸途(tu)徑(jing)是(shi)存(cun)在於(yu)植物、真(zhen)菌和(he)微生物中(zhong)的(de)壹(yi)條重(zhong)要的(de)代謝(xie)途(tu)徑(jing)，莽(mang)草酸脫(tuo)氫酶(mei)是(shi)莽(mang)草酸合(he)成(cheng)途(tu)徑(jing)中(zhong)的(de)關(guan)鍵酶(mei)。

試劑(ji)組成(cheng)和(he)配(pei)制(zhi)：

需(xu)自(zi)備(bei)的(de)儀器和(he)用品(pin)：

紫(zi)外分(fen)光(guang)光度(du)計(ji)/酶(mei)標儀、臺式離(li)心(xin)機、水(shui)浴(yu)鍋(guo)、可調(tiao)式移(yi)液(ye)器、微量石英比色皿(min)/96 孔(kong)板(ban)、研(yan)缽、冰(bing)和(he)蒸(zheng)餾水(shui)。

粗酶(mei)液(ye)提取：

細(xi)菌或培(pei)養細(xi)胞(bao)：

先(xian)收集(ji)細菌或細(xi)胞(bao)到離(li)心(xin)管內，離心(xin)後棄(qi)上(shang)清；按照(zhao)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)數量(liang)（104 個）：提取液(ye)體積(ji)（ml）為 500~1000：1 的(de)比例（建(jian)議 500 萬細(xi)菌或細(xi)胞(bao)加入(ru) 1ml 提取液(ye)），超聲(sheng)波(bo)破碎(sui)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)（冰(bing)浴，功(gong)率(lv) 20％或 200W，超聲(sheng) 3s，間(jian)隔 10s，重(zhong)復(fu) 30 次）；8000g 4℃離心(xin) 10min，取上(shang)清，置冰(bing)上(shang)待(dai)測。

組(zu)織(zhi)：

按照(zhao)組(zu)織(zhi)質量(liang)（g）：提取液(ye)體積(ji)(ml)為 1：5~10 的(de)比例（建(jian)議稱取約 0.1g 組(zu)織(zhi)，加入(ru) 1ml 提取液(ye)），進(jin)行(xing)冰(bing)浴勻(yun)漿。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取上(shang)清，置冰(bing)上(shang)待(dai)測。

測定(ding)步(bu)驟：

1、分(fen)光光(guang)度(du)計(ji)或(huo)酶(mei)標儀預(yu)熱(re) 30min 以上(shang)，調(tiao)節波(bo)長至 340nm，蒸餾水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、樣(yang)本(ben)測定(ding)

在(zai)試劑(ji)二中(zhong)加入(ru) 10ml 試劑(ji)壹充(chong)分溶(rong)解(jie)混(hun)勻(yun)，置(zhi)於(yu) 37℃（哺(bu)乳(ru)動物）或(huo) 25℃（其(qi)它物種(zhong)）水浴(yu) 5min，現(xian)配現(xian)用。

在(zai)微量石英比色皿(min)或 96 孔(kong)板(ban)中(zhong)加入(ru) 10μl 樣(yang)本(ben)和(he) 190μl 試劑(ji)二，混(hun)勻(yun)，立(li)即(ji)記(ji)錄(lu) 340nm 處 20s

時(shi)的吸(xi)光值A1 和(he) 5min20s 後(hou)的(de)吸(xi)光值A2，計(ji)算(suan)ΔA=A2-A1。

SD 活(huo)性(xing)計(ji)算(suan)：

用微量石英比色皿(min)測定(ding)的(de)計(ji)算(suan)公(gong)式如(ru)下(xia)

按樣(yang)本(ben)蛋白(bai)濃度(du)計(ji)算(suan)：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每mg 組織(zhi)蛋白(bai)每分鐘(zhong)產(chan)生 1 nmol 的(de)NADPH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個酶(mei)活力(li)單位(wei)。

SD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本(ben)鮮重(zhong)計(ji)算(suan)：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每g 組織(zhi)每分鐘(zhong)產(chan)生 1 nmol 的(de)NADPH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個酶(mei)活力(li)單位(wei)。

SD（nmol/min/g 鮮重(zhong)）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總) ÷T=643×ΔA÷W

按細(xi)菌或細(xi)胞(bao)密度(du)計(ji)算(suan)：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每 1 萬個細(xi)菌或細(xi)胞(bao)每分鐘(zhong)產(chan)生 1 nmol 的(de)NADPH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個酶(mei)活力(li)單位(wei)。

SD（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總) ÷T=1.286×ΔA

V 反(fan)總：反應體系(xi)總體積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿(min)光徑， 1cm；V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.01ml；V 樣(yang)總：加入(ru)提取液(ye)體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時間(jian)，5 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白(bai)質濃度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本(ben)質量(liang)，g；500：細(xi)菌或細(xi)胞(bao)總數，500 萬。

用 96 孔(kong)板(ban)測定(ding)的(de)計(ji)算(suan)公(gong)式如(ru)下(xia)

(1）按樣(yang)本(ben)蛋白(bai)濃度(du)計(ji)算(suan)：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每mg 組織(zhi)蛋白(bai)每分鐘(zhong)產(chan)生 1 nmol 的(de)NADPH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個酶(mei)活力(li)單位(wei)。

SD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本(ben)鮮重(zhong)計(ji)算(suan)：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每g 組織(zhi)每分鐘(zhong)產(chan)生 1 nmol 的(de)NADPH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個酶(mei)活力(li)單位(wei)。

SD（nmol/min/g 鮮重(zhong)）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣(yang)÷V 樣(yang)總) ÷T=1286×ΔA÷W

按細(xi)菌或細(xi)胞(bao)密度(du)計(ji)算(suan)：

單位(wei)的(de)定(ding)義(yi)：每 1 萬個細(xi)菌或細(xi)胞(bao)每分鐘(zhong)產(chan)生 1 nmol 的(de)NADPH 定(ding)義(yi)為(wei)壹(yi)個酶(mei)活力(li)單位(wei)。

SD（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T=2.572×ΔA

V 反(fan)總：反應體系(xi)總體積(ji)，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔(kong)板(ban)光徑， 0.5cm；V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本(ben)體積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總：加入(ru)提取液(ye)體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時間(jian)，5 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋白(bai)質濃度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本(ben)質量(liang)，g；500：細(xi)菌或細(xi)胞(bao)總數，500 萬。

莽(mang)草酸脫(tuo)氫酶(mei)試劑(ji)盒(he) 其(qi)他系列