丙(bing)*酸羧(suo)化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛(fan)存在於動(dong)物(wu)、黴(mei)菌和酵母(mu)的(de)線粒體中，催(cui)化丙(bing)酮酸、ATP、CO2 和水生(sheng)成(cheng)草酰乙(yi)酸、ADP 和Pi，是糖異生過(guo)程(cheng)的第(di)壹個限(xian)速酶，在保證血(xue)糖的動(dong)態平(ping)衡(heng)方面(mian)起(qi)著(zhe)重要的作(zuo)用(yong)。
丙(bing)*酸羧(suo)化酶PC試(shi)劑盒(he) 糖異生系列

丙(bing)*酸羧(suo)化酶（PC)試(shi)劑盒(he)說明(ming)書(shu)

微量(liang)法(fa) 100 管(guan)/96 樣(yang)

丙(bing)*酸羧(suo)化酶PC試(shi)劑盒(he) 糖異生系列

正(zheng)式(shi)測(ce)定前務必取 2-3 個(ge)預期(qi)差異較(jiao)大的樣(yang)本(ben)做預測(ce)定測定意義：

丙(bing)*酸羧(suo)化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)廣泛(fan)存在於動(dong)物(wu)、黴(mei)菌和酵母(mu)的(de)線粒體中，催(cui)化丙(bing)酮酸、ATP、CO2 和水生(sheng)成(cheng)草酰乙(yi)酸、ADP 和Pi，是糖異生過(guo)程(cheng)的第(di)壹個限(xian)速酶，在保證血(xue)糖的動(dong)態平(ping)衡(heng)方面(mian)起(qi)著(zhe)重要的作(zuo)用(yong)。

測(ce)定原理(li)：

PC 催(cui)化丙(bing)酮酸、ATP、CO2 和水生(sheng)成(cheng)草酰乙(yi)酸、ADP 和Pi，蘋(ping)果(guo)酸脫(tuo)氫(qing)酶進壹步催(cui)化草酰乙(yi)酸和 NADH生(sheng)成(cheng)蘋(ping)果(guo)酸和NAD⁺，在(zai) 340nm 下(xia)測(ce)定NADH 氧(yang)化速率，即(ji)可反(fan)映 PC 活(huo)性(xing)。

組(zu)成(cheng)：

自(zi)備儀器(qi)和用品(pin)：

分光(guang)光(guang)度計(ji)/酶標(biao)儀(yi)、臺(tai)式(shi)離(li)心(xin)機、可調(tiao)式(shi)移(yi)液器(qi)、微量(liang)石(shi)英比(bi)色皿(min)/96 孔(kong)板(ban)、研(yan)缽(bo)、冰(bing)和蒸餾(liu)水。

樣(yang)本(ben)前處(chu)理(li)：

組(zu)織、細菌或(huo)細胞(bao)中胞(bao)漿蛋(dan)白(bai)與(yu)線粒體蛋(dan)白(bai)的分離(li)：

1、 稱(cheng)取約(yue) 0.1g 組(zu)織或(huo)收集(ji) 500 萬細菌或(huo)細胞(bao)，加入(ru) 1ml 提取液，用(yong)冰(bing)浴勻(yun)漿(jiang)器(qi)或(huo)研(yan)缽(bo)勻(yun)漿(jiang)。

2、 將勻(yun)漿(jiang) 600g，4℃離(li)心(xin) 5min。

3、 棄(qi)沈(chen)澱，將上清液移(yi)至(zhi)另(ling)壹離心(xin)管中(zhong)，11000g，4℃離心(xin) 10min。

4、 上(shang)清(qing)液即(ji)胞(bao)漿提取物(wu)，可用(yong)於測(ce)定從(cong)線粒體泄(xie)漏的(de) PC（此(ci)步可選做）。

5、 在(zai)步(bu)驟④的沈(chen)澱中(zhong)加入(ru) 1ml 提取液，超(chao)聲波破(po)碎(sui)（冰(bing)浴，功(gong)率 20％或(huo) 200W，超(chao)聲 3 秒(miao)，間隔(ge) 10 秒，重復30 次(ci)），用(yong)於(yu)線粒體 PC 活性(xing)測(ce)定。

測(ce)定步驟(zhou)：

1、分光(guang)光(guang)度計(ji)或(huo)酶標(biao)儀(yi)預熱(re) 30min 以(yi)上(shang)，調(tiao)節波長至(zhi) 340nm，蒸餾(liu)水調(tiao)零。

工作(zuo)液的(de)配制：臨(lin)用(yong)前將試(shi)劑二和試(shi)劑三轉(zhuan)移到試(shi)劑壹中混(hun)合(he)溶(rong)解(jie)待(dai)用；置於(yu) 37℃(哺(bu)乳動(dong)物(wu))或(huo) 25℃(其(qi)它(ta)物(wu)種(zhong))預熱(re) 5 分鐘；用(yong)不(bu)完的(de)試(shi)劑分裝後-20℃保存，禁(jin)止(zhi)反復(fu)凍融(rong)。

試(shi)劑四的配制：在(zai)試(shi)劑四瓶(ping)中加入(ru) 1mL 蒸餾(liu)水充分溶(rong)解(jie)待(dai)用；用(yong)不(bu)完的(de)試(shi)劑分裝後-20℃保存，禁(jin)止(zhi)反復(fu)凍融(rong)。

2、在(zai)微量(liang)石(shi)英比(bi)色皿(min)或(huo) 96 孔(kong)板(ban)中(zhong)加入(ru) 10μL 樣(yang)本(ben)、10μL 試(shi)劑四和 180μL 工作(zuo)液，立即(ji)混(hun)勻(yun)，記(ji)錄(lu) 340nm處(chu)初(chu)始(shi)吸光值A1 和 2min 後的(de)吸光值A2，計(ji)算(suan)ΔA=A1-A2。

註(zhu)意：在該試(shi)劑盒(he)中(zhong)，若(ruo)ΔA 大於 0.5，需將樣(yang)本(ben)用提取液稀(xi)釋(shi)適(shi)當(dang)倍(bei)數(shu)後測定，使ΔA 小(xiao)於(yu) 0.5 可提高(gao)檢測(ce)靈(ling)敏(min)度。計(ji)算(suan)公式(shi)中(zhong)乘以(yi)相(xiang)應(ying)稀釋(shi)倍數(shu)。 

PC 活(huo)性(xing)計(ji)算(suan)：

用(yong)微量(liang)石(shi)英比(bi)色皿(min)測(ce)定的計(ji)算(suan)公式(shi)如(ru)下

按樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)濃(nong)度(du)計(ji)算(suan)

單位定義：每 mg 組(zu)織蛋(dan)白(bai)每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為壹個酶活力(li)單位。

PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本(ben)鮮重計(ji)算(suan)

單位定義：每 g 組(zu)織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為壹個酶活力(li)單位。

PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=1608×ΔA÷W

按細菌或(huo)細胞(bao)密(mi)度計(ji)算(suan)：

單位定義：每 1 萬個細菌或(huo)細胞(bao)每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為壹個酶活力(li)單位。

PC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=3.215×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反應(ying)體系總(zong)體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消光(guang)系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色皿(min)光(guang)徑(jing)，1cm； V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本(ben)體積，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加入(ru)提取液體積，1 ml；T：反應(ying)時間，2 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)質濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本(ben)質量(liang)，g；500：細菌或(huo)細胞(bao)總(zong)數，500 萬。

用(yong) 96 孔(kong)板(ban)測(ce)定的計(ji)算(suan)公式(shi)如(ru)下

按樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)濃(nong)度(du)計(ji)算(suan)

單位定義：每 mg 組(zu)織蛋(dan)白(bai)每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為壹個酶活力(li)單位。

PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(V 樣(yang)×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣(yang)本(ben)鮮重計(ji)算(suan)

單位定義：每 g 組(zu)織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為壹個酶活力(li)單位。

PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=3216×ΔA÷W

按細菌或(huo)細胞(bao)密(mi)度計(ji)算(suan)：

單位定義：每 1 萬個細菌或(huo)細胞(bao)每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為壹個酶活力(li)單位。

PC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反(fan)總(zong)÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T=6.43×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反應(ying)體系總(zong)體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾(er)消光(guang)系數，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔(kong)板(ban)光(guang)徑，0.5cm； V 樣(yang)：加入(ru)樣(yang)本(ben)體積，0.01 ml；V 樣(yang)總(zong)：加入(ru)提取液體積，1 ml；T：反應(ying)時間，2 min；Cpr：樣(yang)本(ben)蛋(dan)白(bai)質濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣(yang)本(ben)質量(liang)，g；500：細菌或(huo)細胞(bao)總(zong)數，500 萬。

丙(bing)*酸羧(suo)化酶PC試(shi)劑盒(he) 糖異生系列