ACC在生(sheng)物(wu)體(ti)內(nei)催(cui)化乙酰輔meiA羧化生(sheng)成(cheng)丙(bing)二(er)酰輔meiA，是(shi)脂肪酸(suan)和(he)許多次(ci)生(sheng)代(dai)謝產物合(he)成(cheng)的(de)關鍵酶。ACC的(de)活(huo)性(xing)在壹(yi)定程度上決(jue)定了脂肪酸(suan)的(de)合(he)成(cheng)速(su)度和(he)含油量(liang)的(de)高低(di)。
乙酰輔meiA羧化酶試劑盒 脂肪酸(suan)系列(lie)

乙酰輔meiA 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)試劑盒說明(ming)書

分光光度法 50 管/24 樣

乙酰輔meiA羧化酶試劑盒 脂肪酸(suan)系列(lie)

正式(shi)測(ce)定前務必(bi)取 2-3 個(ge)預期差異(yi)較(jiao)大的(de)樣本(ben)做預測定測定意(yi)義(yi)：

ACC在生(sheng)物(wu)體(ti)內(nei)催(cui)化乙酰輔meiA羧化生(sheng)成(cheng)丙(bing)二(er)酰輔meiA，是(shi)脂肪酸(suan)和(he)許多次(ci)生(sheng)代(dai)謝產物合(he)成(cheng)的(de)關鍵酶。ACC的(de)活(huo)性(xing)在壹(yi)定程度上決(jue)定了脂肪酸(suan)的(de)合(he)成(cheng)速(su)度和(he)含油量(liang)的(de)高低(di)。

測(ce)定原理：

ACC 能夠催(cui)化乙酰輔meiA、NaHCO3 和(he)ATP 生(sheng)成(cheng)丙(bing)二(er)酰輔meiA、ATP 和(he)無(wu)機磷(lin)，通過鉬(mu)酸銨(an)定磷(lin)法(fa)測定無(wu)機磷(lin)的(de)增加量來(lai)測定 ACC 活(huo)性(xing)。

組成：

試劑四(si)：粉(fen)劑(ji)×1 瓶(ping), 4℃保存。用(yong)時(shi)加入 25ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，溶解後(hou) 4℃可保存壹(yi)周。試劑五(wu)：粉(fen)劑(ji)×1 瓶, 4℃保存。用(yong)時(shi)加入 25ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，溶解後(hou) 4℃可保存壹(yi)周。試劑七(qi)：10μmol/ml 標(biao)準(zhun)磷(lin)貯備(bei)液 10ml×1 瓶(ping)，4℃保存。

自(zi)備(bei)儀(yi)器和(he)用(yong)品：

分光光度計(ji)、恒溫水(shui)浴鍋(guo)、臺(tai)式(shi)離(li)心(xin)機(ji)、可調(tiao)式(shi)移(yi)液器、1 ml 玻(bo)璃(li)比色皿、研缽(bo)、冰(bing)和(he)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

樣本(ben)的(de)前處(chu)理:

1、細菌(jun)或培養細(xi)胞(bao)：先(xian)收集(ji)細菌或(huo)細(xi)胞(bao)到(dao)離心(xin)管內，離(li)心(xin)後(hou)棄上清；按照(zhao)細(xi)菌或細(xi)胞(bao)數(shu)量（104 個(ge)）：提取(qu)液(ye)體(ti)積（ml）為 500~1000：1 的(de)比例（建議(yi) 500 萬(wan)細菌或(huo)細胞(bao)加入 1ml 提(ti)取(qu)液），超聲(sheng)波破(po)碎(sui)細(xi)菌(jun)或(huo)細(xi)胞(bao)（冰(bing)浴，功率 20％或(huo) 200W，超聲(sheng) 3s，間(jian)隔 10s，重復(fu) 30 次(ci)）；8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清，置冰上待(dai)測(ce)。

2、組織：按照組(zu)織質量（g）：提(ti)取液(ye)體(ti)積(ml)為 1：5~10 的(de)比例（建議(yi)稱(cheng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 提(ti)取(qu)液），進行(xing)冰(bing)浴勻漿(jiang)。8000g 4℃離心(xin) 10min，取(qu)上清，置冰上待(dai)測(ce)。

測定步驟(zhou):

1、分光(guang)光(guang)度計(ji)預熱 30min 以(yi)上，調(tiao)節(jie)波長(chang)至 660nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調(tiao)零(ling)。

2、酶促反應試劑的(de)配制和(he)預熱：在試劑二(er)瓶中加入 6.5ml 試(shi)劑(ji)壹(yi)，充分溶解混勻；在試劑三瓶中加入 5ml

蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，充分溶解混勻；將試(shi)劑(ji)壹(yi)、二(er)、三在 37℃(哺(bu)乳(ru)動物(wu))或(huo) 25℃(其(qi)它(ta)物種(zhong))預熱 10 分(fen)鐘。

3、定磷(lin)試(shi)劑的(de)配制：按 H2O: 試(shi)劑(ji)四(si):試(shi)劑(ji)五(wu):試(shi)劑(ji)六(liu)=2:1:1:1 的(de)比例配制，配好的(de)定磷(lin)試(shi)劑應為淺黃色，若(ruo)無(wu)色則(ze)試劑(ji)失效(xiao)，若(ruo)是(shi)藍(lan)色(se)則為磷(lin)汙(wu)染，定磷(lin)劑(ji)現用(yong)現(xian)配。

註意(yi)：配(pei)試(shi)劑最(zui)好用(yong)新的(de)燒杯(bei)、玻(bo)棒和(he)玻(bo)璃(li)移(yi)液器，也可以(yi)用(yong)壹(yi)次(ci)性(xing)塑(su)料(liao)器皿，避(bi)免(mian)磷(lin)汙(wu)染。

4、0.5μmol/ml 標(biao)準(zhun)磷(lin)應用(yong)液(ye)配制：將試(shi)劑(ji)七(qi) 20 倍(bei)稀(xi)釋，即取(qu) 0.5ml 試劑七(qi)加 9.5 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，充分混勻。

5、酶促反應

37℃（哺(bu)乳(ru)動物(wu)）或(huo) 25℃（其(qi)它(ta)物種(zhong)）準(zhun)確反應 30min 後，90℃水(shui)浴 5min（蓋緊，以(yi)防(fang)止(zhi)水(shui)分散(san)失），冷(leng)卻後(hou)，10000g 25℃離心(xin) 5min，取(qu)上清

6、定磷(lin)

混勻，37℃（哺(bu)乳(ru)動物(wu)）或(huo) 25℃（其(qi)它(ta)物種(zhong)）水(shui)浴 30min，冷(leng)卻至(zhi)室溫，在 660nm 處，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調(tiao)零(ling)，記(ji)錄各(ge)管吸光(guang)值A。標(biao)準(zhun)管、空白(bai)管只要(yao)做壹(yi)次(ci)即可，每(mei)個(ge)測定管需(xu)要(yao)設壹(yi)個(ge)對照管。

註意(yi)：若(ruo)測定管吸光(guang)值大於(yu) 2，將樣品用(yong)提(ti)取液稀(xi)釋適當(dang)倍(bei)數(shu)後(hou)再進行(xing)測定，使吸光(guang)值小於(yu) 2，可提(ti)高檢(jian)測靈(ling)敏(min)度，計(ji)算(suan)公式(shi)中乘(cheng)以相應稀(xi)釋倍(bei)數(shu)。

ACC 活(huo)性(xing)計(ji)算(suan)：

1、按(an)組(zu)織蛋(dan)白(bai)濃(nong)度計(ji)算(suan)：

定義：每(mei)小時(shi)每(mei)毫克組(zu)織蛋(dan)白(bai)產生(sheng) 1μmol 無(wu)機磷(lin)的(de)量為壹(yi)個(ge) ACC 活(huo)力(li)單(dan)位。

ACC (μmol/h/mg prot)=(C 標(biao)準(zhun)管×V 總)×(A 測(ce)定管-A 對照管)÷(A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管)÷ (V 樣×Cpr)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管)÷Cpr

2、按樣本(ben)鮮重計(ji)算(suan)：

定義：每(mei)小時(shi)每(mei)g 組(zu)織產生(sheng) 1μmol 無(wu)機磷(lin)的(de)量為壹(yi)個(ge) ACC 活(huo)力(li)單(dan)位。

ACC (μmol/h/g 鮮重)=(C 標(biao)準(zhun)管×V 總)×(A 測(ce)定管-A 對照管)÷(A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）÷ (W× V 樣÷V 樣總)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管)÷W

3、按細(xi)菌或(huo)細胞(bao)密(mi)度計(ji)算(suan)：

定義：每(mei)小時(shi)每(mei) 500 萬(wan)細(xi)菌或(huo)細胞(bao)產生(sheng) 1μmol 無(wu)機磷(lin)的(de)量為壹(yi)個(ge) ACC 活(huo)力(li)單(dan)位。

ACC (μmol/h/104 cell)=(C 標(biao)準(zhun)管×V 總)×(A 測(ce)定管-A 對照管)÷(A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管）÷ (500× V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biao)準(zhun)管-A 空白(bai)管)

C 標(biao)準(zhun)管：標(biao)準(zhun)管濃(nong)度，0.5μmol/ml；V 總：酶促反應總體(ti)積，0.5ml；V 樣：加入樣本(ben)體(ti)積，0.05ml ；V樣總：加入提(ti)取(qu)液體(ti)積，1ml；T：反應時間(jian)，0.5 小時(shi)；Cpr：樣本(ben)蛋(dan)白(bai)質濃(nong)度，mg/ml；W：樣本(ben)鮮重，g； 500：細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)總(zong)數，500 萬。

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