PDC 催化丙(bing)酮(tong)酸脫羧(suo)生成乙醛，添加乙醇(chun)脫氫酶（ADH）來進壹(yi)步(bu)催化 NADH 還(hai)原乙醛生成乙醇(chun)和(he)NAD+；NADH 在(zai) 340 nm 有吸(xi)收(shou)峰(feng)，而(er) NAD+沒有；通(tong)過測(ce)定 340 nm 光(guang)吸(xi)收(shou)下降(jiang)速率(lv)，來計(ji)算 PDC 活性(xing)。
丙(bing)酮酸脫羧(suo)酶PDC活性(xing)測(ce)定試劑(ji)盒(he) 脂肪(fang)酸(suan)系(xi)列(lie)

丙酮(tong)酸(suan)脫羧(suo)酶（PDC）活性(xing)測(ce)定試劑(ji)盒(he)說(shuo)明(ming)書

微量法 100T/96S

丙酮(tong)酸(suan)脫羧(suo)酶PDC活性(xing)測(ce)定試劑(ji)盒(he) 脂肪(fang)酸(suan)系(xi)列(lie)

正式(shi)測定前(qian)務(wu)必(bi)取 2-3 個(ge)預期差異較(jiao)大的(de)樣本(ben)做(zuo)預測定測(ce)定意(yi)義：

PDC 主要(yao)存(cun)在於(yu)酵(jiao)母(mu)中(zhong)，是(shi)乙醇(chun)發酵(jiao)的(de)關(guan)鍵(jian)酶之壹(yi)，催化丙(bing)酮(tong)酸脫羧(suo)生成乙醛。

測定原理：

PDC 催化丙(bing)酮(tong)酸脫羧(suo)生成乙醛，添加乙醇(chun)脫氫酶（ADH）來進壹(yi)步(bu)催化 NADH 還原乙醛生成乙醇(chun)和(he)NAD⁺；NADH 在 340 nm 有吸(xi)收(shou)峰(feng)，而(er) NAD⁺沒有；通(tong)過測(ce)定 340 nm 光吸(xi)收(shou)下降(jiang)速率(lv)，來計(ji)算 PDC 活性(xing)。

組成(cheng)：

混合試劑(ji)：臨用(yong)前(qian)配制(zhi)，將試劑(ji)四和(he)試劑(ji)五轉(zhuan)移至試劑(ji)三中(zhong)充(chong)分(fen)溶(rong)解待用(yong)，用(yong)不完的(de)試劑(ji)分裝後-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止(zhi)反(fan)復凍(dong)融。

自(zi)備(bei)儀(yi)器和(he)用(yong)品：

研缽(bo)、冰(bing)、臺(tai)式(shi)離心(xin)機(ji)、紫(zi)外分光(guang)光(guang)度(du)計/酶標儀、微量石英比(bi)色皿/96 孔板、可(ke)調式(shi)移液(ye)槍(qiang)

粗酶液提取：

1、細菌(jun)或(huo)細胞(bao)處理：收(shou)集(ji)細菌(jun)或(huo)細胞(bao)到(dao)離心(xin)管內，離心(xin)後棄(qi)上(shang)清(qing)；按照(zhao)每(mei) 200 萬(wan)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)加(jia)入 400μl提取液(ye)，超(chao)聲(sheng)波(bo)破碎(sui)細(xi)菌(jun)或(huo)細胞(bao)（功(gong)率 200W，工作 3s，間歇(xie) 10s，工作 35 次(ci)），16000g 4℃離心(xin) 20min，取上(shang)清(qing)，置冰上(shang)待測。

2、組織(zhi)處理：按(an)照(zhao)組(zu)織(zhi)質(zhi)量（g）：試劑(ji)壹(yi)體(ti)積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的(de)比(bi)例（建(jian)議稱取約(yue) 0.1g 組(zu)織，加(jia)入 1ml試劑(ji)壹(yi)）進行冰浴(yu)勻(yun)漿(jiang)，16000g 4℃離(li)心(xin) 20min，取上(shang)清(qing)，置冰上(shang)待測。 3、血(xue)清(qing)（漿(jiang)）樣(yang)品：直接檢(jian)測(ce)。

PDC 測定操(cao)作：

分光(guang)光(guang)度(du)計/酶標儀預熱 30min，調節波(bo)長到(dao) 340 nm，蒸餾(liu)水(shui)調零(ling)。

試劑(ji)二(er)置於(yu) 25℃水(shui)浴(yu)中(zhong)預熱 30min。

空(kong)白(bai)管：依次(ci)在微量石英比(bi)色皿/96 孔板中(zhong)加(jia)入 20μl 蒸(zheng)餾水、20μl 混合試劑(ji)、140μl 試劑(ji)二(er)和(he) 20μl 試劑(ji)六，迅速混勻後於(yu) 340nm 比(bi)色，記錄 15s 和(he) 75s 的(de)吸(xi)光值，分別(bie)記為A1 和(he)A2。

測定管：依次(ci)在微量石英比(bi)色皿/96 孔板中(zhong)加(jia)入 20μl 上(shang)清(qing)液、20μl 混合試劑(ji)、140μl 試劑(ji)二(er)和(he) 20μl 試劑(ji)

六，迅速混勻後於(yu) 340nm 比(bi)色，記錄 15s 和(he) 75s 的(de)吸(xi)光值，分別(bie)記為A3 和(he)A4。

註意(yi)：空(kong)白(bai)管只(zhi)需測(ce)定壹(yi)次(ci)。

PDC 活性(xing)計(ji)算：

使用(yong)微量石英比(bi)色皿測定的(de)計算(suan)公式(shi)如(ru)下

按照(zhao)蛋(dan)白(bai)濃度(du)計算

活性(xing)單(dan)位定義：25℃中(zhong)，每(mei)毫(hao)克(ke)蛋(dan)白每(mei)分鐘(zhong)催化 1nmol NADH 氧(yang)化為(wei) 1 個(ge)酶活單位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(Cpr×V 樣) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

按照(zhao)樣(yang)本(ben)質(zhi)量計算(suan)

活性(xing)單(dan)位定義：25℃中(zhong)，每(mei)克(ke)組(zu)織(zhi)每分(fen)鐘催化 1nmol NADH 氧(yang)化為(wei) 1 個(ge)酶活單位。

PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

按細(xi)胞(bao)數(shu)量計算(suan)

活性(xing)單(dan)位定義：25℃中(zhong)，每(mei) 104 個(ge)細胞(bao)每(mei)分(fen)鐘(zhong)催化 1nmol NADH 氧(yang)化為(wei) 1 個(ge)酶活單位。

PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(細胞(bao)數(shu)量×V 樣÷V 樣(yang)總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細胞(bao)數(shu)量

按血(xue)清(qing)（漿(jiang)）體(ti)積(ji)計(ji)算(suan)

活性(xing)單(dan)位定義：25℃中(zhong)，每(mei)毫(hao)升(sheng)血(xue)清(qing)（漿(jiang)）每(mei)分鐘催化 1nmol NADH 氧(yang)化為(wei) 1 個(ge)酶活單位。PDC (nmol/min

/ml) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷V 樣÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH 摩爾(er)消(xiao)光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×103L/mol/cm；d：比(bi)色皿光徑，1cm；V 總：反(fan)應(ying)體系(xi)總體積(ji)，0.2ml=2×10-4 L，V 樣(yang)：加(jia)入反(fan)應(ying)體系(xi)中(zhong)上(shang)清(qing)液體積(ji)，0.02ml；V 樣(yang)總：提取液(ye)體(ti)積(ji)，1 ml；Cpr：蛋(dan)白(bai)濃度(du)（mg/ml），需要(yao)另外(wai)測定，建(jian)議使用(yong)本(ben)公司(si)BCA 蛋(dan)白質(zhi)含量試劑(ji)盒(he)；W ：樣品質量； T：反(fan)應(ying)時間，1 min。

使用(yong) 96 孔板測(ce)定的(de)計算(suan)公式(shi)如(ru)下

按照(zhao)蛋(dan)白(bai)濃度(du)計算

活性(xing)單(dan)位定義：25℃中(zhong)，每(mei)毫(hao)克(ke)蛋(dan)白每(mei)分鐘(zhong)催化 1nmol NADH 氧(yang)化為(wei) 1 個(ge)酶活單位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(Cpr×V 樣) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

按照(zhao)樣(yang)本(ben)質(zhi)量計算(suan)

活性(xing)單(dan)位定義：25℃中(zhong)，每(mei)克(ke)組(zu)織(zhi)每分(fen)鐘催化 1nmol NADH 氧(yang)化為(wei) 1 個(ge)酶活單位。

PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

按細(xi)胞(bao)數(shu)量計算(suan)

活性(xing)單(dan)位定義：25℃中(zhong)，每(mei) 104 個(ge)細胞(bao)每(mei)分(fen)鐘(zhong)催化 1nmol NADH 氧(yang)化為(wei) 1 個(ge)酶活單位。

PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(細胞(bao)數(shu)量×V 樣÷V 樣(yang)總) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細胞(bao)數(shu)量

按血(xue)清(qing)（漿(jiang)）體(ti)積(ji)計(ji)算(suan)

活性(xing)單(dan)位定義：25℃中(zhong)，每(mei)毫(hao)升(sheng)血(xue)清(qing)（漿(jiang)）每(mei)分鐘催化 1nmol NADH 氧(yang)化為(wei) 1 個(ge)酶活單位。PDC (nmol/min

/ml) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷V 樣÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH 摩爾(er)消(xiao)光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×103L/mol/cm；d：96 孔板光(guang)徑，0.5 cm；V 總：反(fan)應(ying)體系(xi)總體積(ji)，0.2ml=2×10-4 L，V 樣(yang)：加(jia)入反(fan)應(ying)體系(xi)中(zhong)上(shang)清(qing)液體積(ji)，0.02ml；V 樣(yang)總：提取液(ye)體(ti)積(ji)，1 ml；Cpr：蛋(dan)白(bai)濃度(du)（mg/ml），需要(yao)另外(wai)測定，建(jian)議使用(yong)本(ben)公司(si)BCA 蛋(dan)白質(zhi)含量試劑(ji)盒(he)；W ：樣品質量； T：反(fan)應(ying)時間，1 min。

丙酮(tong)酸(suan)脫羧(suo)酶PDC活性(xing)測(ce)定試劑(ji)盒(he) 脂肪(fang)酸(suan)系(xi)列(lie)